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(無題) 削除/引用 No.1172-16 - 2008/05/26 (月) 14:44:37 - Transplant 液量（マスターミックスの量）が少ないと検出感度は鈍くなる気がしますね． （以前にマスターミックスの量を2×→3×にケチってやったことがありますが，結果は惨敗，酷いもんでした） 今までの話をまとめますと， 最高感度を出すためには １）アルファ型酵素配合のミックス使用 ２）PCR反応の条件改良（伸長時間延長など） ３）推奨液量で反応 が必要ということですね． 反応時間の変更・改良はすぐにでもできそうなので一度比較実験をやってみようと思います． あ，ABIはPol型酵素だったんですね．じゃあRocheもPol型だと思われます．Rocheはいろいろ改良されているようなのでパフォーマンス高いですが．（どういうことかはご想像にお任せします） 今回のトピは脱線し過ぎですが（笑）知らなかったことも多く，いい勉強になりました．ありがとうございました．

(無題) 削除/引用 No.1172-15 - 2008/05/24 (土) 23:02:15 - けん 時間を変えると精度が上がると思っていますが、 理論がそうなだけで、実際に影響しているかは不明です。 わかったら教えてください。 ただ分子数が少ない因子は、間違いなく誤差が減りますね。

(無題) 削除/引用 No.1172-14 - 2008/05/24 (土) 23:00:00 - けん ABIの機械（だったと思いますが）は検出点が２５μのラインにあると聞いたことがあります。だから２５μ以下の液量では焦点が合わないとか… 知りませんでした。 あなたと話ができてよかったです。 ただ20ulの系でも昔やっていましたが、定量性はしっかりしています。 ノイズの割合が増えてしまうのかもしれませんね。 目下のところは、偶然ですが、 発現量の少ない遺伝子をターゲットにしていますので、 25ulで行っていました。運がよかったです。。。 今後は20より下には下げないようにします。 アドバイスありがとうございます。 ABI社のものはともにpolI型なので立ち上がりが遅いですね。 インビトロジェんはやりましたが、可もなく不可もなくでした。。。

(無題) 削除/引用 No.1172-13 - 2008/05/23 (金) 21:20:16 - Transplant PowerSYBR(ABI) →ABIの古いタイプのSYBRの方が良好らしいですね。 どうやら委託先の製造会社が変更されたらしいです。 古い方は在庫ある限りでとりあえず製造中止するとかしないとか…。 （私は使わないので関係ないのですが） PCR系について →PCR反応条件の変性・伸長時間長めに設定することで立ち上がりを早めるというのは面白そうですね。 早く立ち上がるということはベースラインの傾きも急になりますよね？ということはそれだけで精度が上がるような気がするんですが…違います？ →普通２０μ、弱いと５０μとありますが、ABIの機械（だったと思いますが）は検出点が２５μのラインにあると聞いたことがあります。だから２５μ以下の液量では焦点が合わないとか… 私はそれを知ってから２０μ→３０μに変更しました。 もしABIをお使いの方は一度お試しを。

(無題) 削除/引用 No.1172-12 - 2008/05/23 (金) 20:41:24 - けん 個人的にはプロトコール通りのサイクルは組まず、 変性時間、伸長時間共に少し伸ばすことで、 立ち上がりを早くしています。 1サイクル数%でも後々ジャブのように効いてきますからね。 ２５ サイクル後には、数サイクル分くらいは違うのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1172-11 - 2008/05/23 (金) 20:37:19 - けん rocheのものは試したことがないですね。 いつか機会があれば試してみたいです。 とりあえずtakaraのはα型の酵素が含まれているので、 かなり増幅効率は高いと思います。 20μlの系で行っていますがシグナルが弱ければ50ulでやります。 powersybr(ABI)はへちょい上に高価です。 確か半額キャンペーンでも高いと感じた気がします。

(無題) 削除/引用 No.1172-10 - 2008/05/23 (金) 17:11:51 - Transplant カラムによるRNA抽出について →質が良いという言い回しは少し不適切だったかもしれません． テクニックによるものと思われますが，トリゾル系よりもカラムの方が波形が綺麗に出易いということだけです．（抽出後にすべてDNase処理していますので，結局手間は変わらないんですが．） DNase処理について →私も実験を重ねているうちにDNase処理の重要さに気づき，ガッチリ処理しています． どこぞやのトピックで『DNaseが効率よく働くにはCaが必要』という書き込みがあったので，そこに載っていたオリジナルのCaを含む，10×DNase bufferを自分で調製して使っています．非常に良好です． SYBRメーカー比較について →今はRocheのfast start SYBR green mastermix(ROX)を使用しています．使用感はABIのものよりも良かったので切り替えました．（価格もだいぶリーズナブルですし．） 少サンプルの際，TaKaRaのものと一度比較してみます． カラム抽出では低分子をロスるというのは私もどこかで聞いたことがあります．（今の実験は低分子RNAは必要ないので問題ないかなと思っていますが，本当の意味でのtotalRNAではないので正確にはtotalではないですね．やはり，厳密にmRNA量の比較をする時はトリゾル系の方が系の保存性が良いということですね．）

(無題) 削除/引用 No.1172-9 - 2008/05/23 (金) 12:58:09 - けん 逆に質問ですが、カラムの方が質がいいというのは本当ですか？ 自分も参考にさせていただきたいです。 確か低分子量RNAは除去されましたよね。 少なくともAGPC法（とりぞーる）では非常に均一なデータが出ています。 実験操作はその分難しいですが。（中間層がかなりゆるいですからね） pg単位のスケールでもリアルタイムPCRをすることは十分可能ですので、 1個体でも十分そうですが、いかがなんでしょうか。 ちなみにシグナルは、 1、taqman 2、sybr(TAKARA extaq sybr) 3、sybr(ABI) の順にシグナルが強いので、 もしSYBRでしたらtakara社のものを試してみることをお勧めします。 あとDNase処理も重要です。 昔は混入するDNAは少量だからと無視していたのですが、 意外に厳密な定量の場合、精度に響いてくることを感じている今日この頃です。

なるほど。 削除/引用 No.1172-8 - 2008/05/23 (金) 12:14:34 - Transplant やっぱりキチっとした定量はサンプル量増やさないと難しそうですね。 ちなみに私はフェノール系抽出液はトリゾルではなく、ＴａＫａＲａのRNAisoを使用しています。同じようなものですが。 カラムの方がＲＮＡの質がいいので少数サンプルの時はRNeasy、組織や多量サンプルの時はRNAisoと使い分けています。

(無題) 削除/引用 No.1172-7 - 2008/05/22 (木) 20:49:15 - けん 文章をよく読んでいませんでした。 やった経験則上cells direct キットはあまり定量には向きません。 大雑把な定量には向きます。 30%ぐらいは誤差の範囲内です。 Trizol試薬とか使ったことありますか？ 自分はいいデータが得られていますが。 全血からなら個体数を増やすしかないのではないでしょうか。 けちるとこういう実験はだめです。 個体数を3倍にすればロスが減るので、 終了は5倍くらいになると思います。

(無題) 削除/引用 No.1172-6 - 2008/05/22 (木) 20:44:57 - けん こんばんわ。 前述の文章ですが、シグナルは弱めですがの間違いです。 RNA抽出ですが、クローニング目的ですか？ でしたらどの方法でもかまわないと思います。 エタチンの際、グリコーゲンを極少量加えてください。 濃度測定で0でもPCRでクローニングすることは可能です。 要は1分子あればいいわけですから。

(無題) 削除/引用 No.1172-5 - 2008/05/21 (水) 20:57:34 - Transplant 10＾5くらいもあればＧＡＰＤＨなんかは検出できるのですが、ＲＮＡ抽出時にロスることが多いようで（抽出でのロスでなくて、全血から分離・精製-保存の段階でのダメージのせいなのかもしれませんが）、Ｒｅａｌ-Ｔｉｍｅにかけると発現量の少ないターゲットだと検出できないことが多いです。 目的はｍＲＮＡ発現量の定量なのでマズイなと…。 ですから、スモールスケールのＲＮＡ抽出でも効率のいい（または定評のある）キットってありませんか？ ちなみに現在はRNeasyMini&Micro kit使用です。

(無題) 削除/引用 No.1172-4 - 2008/05/21 (水) 20:24:21 - う〜んと 少量の試料からやったことないですけど、Jurkatなんかでも10^4程度だと同じようにGAPDHでも増えませんか？ T細胞を分離する過程で元気がなくなってる可能性はないでしょうか？

お騒がせしました． 削除/引用 No.1172-3 - 2008/05/21 (水) 19:22:24 - Transplant 取説によると， The performance of this kit was verified several different mammalian cell lines, including Hela, COS-7, 293, Jurkat, CV1, and K562. Cells may be grown under variety of conditions and treatments. Any type of culture vessel can be used. とあります． …よく読まなかった私が悪そうですね．すいません． では質問を変えまして，例えば，数の少ない細胞サンプルからRT-PCRまでもっていくのに皆さんはどんな方法でRNA抽出します？ やはり少サンプル向けの抽出キット（RNeasy micro kit等）が主流になるのでしょうか？ スピンカラム方式のキットの精製度は高いですが，量がだいぶ減るような気がするのであまり好きになれないのですが．

(無題) 削除/引用 No.1172-2 - 2008/05/21 (水) 13:18:08 - けん 私は血液由来の細胞はやったことはありませんが、 良好な結果が出ていますよ。 確かにややシグナルが大目ですが。 血液の細胞でも可能なんでしょうか？

Cells Direct cDNA Synthesis 削除/引用 No.1172-1 - 2008/05/20 (火) 16:46:31 - Transplant 今回，少量の細胞（１０∧４未満〜１０∧５程度の全血から分離したT−cell）からRNA→cDNA→RT-PCTすることになったのですが，抽出時のロスを考え，細胞から直接cDNAを作れるキットを使用しました． もちろん手順，細胞量も規定通り行ったのですが，GAPDHやb-actinですらとてつもなく薄いバンドしか出ません． このタイプのキットを使ったことがあり，何か気づいたことがある方は是非アドバイスをお願いします． ちなみに普通にRNA抽出→cDNA合成→RT-PCRした時はバッチリ出ていますのでPCRが悪いとは考えにくいのですが…

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