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(無題) 削除/引用 No.1182-16 - 2008/05/26 (月) 09:35:48 - 蛍 >おお様 なるほどありがとうございます。参考になります。 論文投稿の際には重ね合わせ画像に加えて（2D）、3Dでの図を作製して持ちいれたら明瞭でしょうね。 今までのアドバイスを踏まえつつ、挑戦してみたいと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1182-15 - 2008/05/25 (日) 10:45:45 - おお > ちなみに、論文等に投稿する際、細胞内タンパク質の局在を示す図でこのような重ね合わせ画像を用いても何ら差し支えないのでしょうか？ あ、加えて3Dイメージとして投稿というてもあるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1182-14 - 2008/05/25 (日) 10:42:13 - おお > > ちなみに、論文等に投稿する際、細胞内タンパク質の局在を示す図でこのような重ね合わせ画像を用いても何ら差し支えないのでしょうか？ メソッドを書いておけば誤解が生じないので、大丈夫だと思います。加えて、xーy平面状では、アクチンファイバーがz軸上に横切っている事を考察しておくといいかもしれません。見かける論文ではそういう方法をしっかり書いてないので誤解を生じるという例がもあると思いますが、そこまでてを抜くことはわたし的には勧めません。ターミノロジー(用語)があると思いますが、ちょっと思い出せません。マニュアルとかに書いてありそうですが、、、、

(無題) 削除/引用 No.1182-13 - 2008/05/25 (日) 10:00:29 - 蛍 >おお様 ここまでご相談に乗って頂いているにも関わらず情報を提供できず、大変申し訳ないです。すみません。 確かに、いつもはZ軸の一平面での画像を解析しておりました。 おお様のご意見を聞き、さっそくZ軸で画像を重ね合わせて見た所、Helaほどではありませんがアクチンに対して画像の改善が見られました。 こうするとやはり、画像が見えにくくなっているのは細胞が嵩高いものだからという要因も多分にあるのかと思います。 アドバイスありがとうございます。 ちなみに、論文等に投稿する際、細胞内タンパク質の局在を示す図でこのような重ね合わせ画像を用いても何ら差し支えないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1182-12 - 2008/05/25 (日) 09:01:21 - おお あ、きょう焦点、デコンボリューションをお使いのようですが、イメージは一平面のイメージをアウトプットとして出していますスカ? Ｚ軸方向で移動させ、それを重ね合わせて、あたかも上から見たような画像を取ってみればどうでしょうか?アクチンのファイバーが一平面を横切っているため、みにくいかもしれまいと思いました。この方法のターミノロジーを思い出せませんが、動物の脳切片などで、神経軸索を示すのによくつかわれています。

(無題) 削除/引用 No.1182-11 - 2008/05/25 (日) 03:14:53 - おお 差し支えなければ細胞名を公表してみてはどうでしょうか。もう少し詳しい情報が手に入るかもしれませんし。

(無題) 削除/引用 No.1182-10 - 2008/05/24 (土) 18:49:37 - 蛍 >おお様 私は実験を少しかじっただけで、未熟な所が多々あるのでご意見、とても参考になります。 tritonX-100処理を行わなくてもそのような事象が考えられるのならば、試してみる価値はありますね。 ありがとうございます。 アクチンの安定化については、微小管は低温で固定すると破壊される可能性があるということもいわれていますから、同様にアクチンに対する適切な固定条件を検討していくことも課題なのかと考えております。 >sea様 最初の意図通りの返答ができずすみませんでした。 アドバイス、とても参考になります。ありがとうございます。 確かに、培養時はコラーゲンコート等、特に細胞外マトリックスを用いての培養は行っておりません。 しかし、蛍光顕微鏡での観察時はコラーゲンコートしております。（研究の都合上外せない条件ですので） 私の用いているがん細胞は特に自ら確立したものでもなく、一般的な細胞バンクからいただいたものであります。 この細胞に対して免疫染色を行っている論文も出ているのですが、私の期待するような明瞭な観察像を解析できているものは今まで見たことがないです。それらの論文で行っている条件も私の行っている条件とほとんど大差ない感じです。 その点、とても染色しづらいものなのかもしれませんね。 sea様のおっしゃられる通り、他の抗原マーカーを用いての観察と共焦点での観察を改めて試みたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1182-9 - 2008/05/24 (土) 04:29:14 - sea >言い忘れてしまって申し訳ありませんが、私が通常細胞を蛍光観察する時 >は、35 mmdishにカバーガラスを入れてコラーゲンコートした後に、そのカ >バーガラス上で細胞を生やし、プレパラートにして観察を行っております。 おっと、それではだいぶ的外れなことを書いてしまいましたね。 私の最初の質問の意図、培養条件の違い、とはまさにこのことです。 通常の培養でもディッシュにコラーゲンコートをしているのか、 染色用のときだけコーティングをしているのか、も確認しないと いけなさそうですが、つまり、マトリックスタンパクの違いによって 細胞骨格に影響が出る細胞の可能性はないかな、と思ったのです。 ただ、染色後の細胞も形態的に問題ない、ということだったので あまりそういうことを考える必要はないのかもしれません。 ちなみにこれは自分たちのラボで確立した細胞株ですか？それとも もらいもの/買ったものですか？ 後者ならこれまでに検討された至適染色条件があるでしょうし マーカーもあるでしょうからそれを試す価値はあるでしょう。 前者なら確かに自分たちで条件検討をする必要がもう少しあるのかも しれません。それにしても期待されたマーカーの染色とかも 並行してやってみたほうがいいと思いますよ。 あと、確かに最初に読んだときに結腸由来のガン細胞、ということだったので 丈の高い細胞の可能性も考えていたのですが、培養条件下でも確かに 丈が高いとなると、その分actin filamentも重なって見えて、結果的に ぼやけてみえるかもしれないですね。 その場合には共焦点のほうがいいんでしょうね。 色々書いてしまいましたがまとめると、 (1) 染色前培養条件、前処理の妥当性の検討のためにほかのマーカーでも染めてみる (2) 厚みの問題の可能性を考えて、共焦点を使ってみる(可能なら) 蛍さんやおおさんが書いておられるようなactinの生理的な不安定さや 固定後の不安定さの可能性は否定しませんが、それを評価する方法について 今は少し思いつきません。 すみません。

(無題) 削除/引用 No.1182-8 - 2008/05/24 (土) 00:24:36 - おお >[Re:4] seaさんは書きました : > > ちなみにホルマリン固定でtargetが細胞内なのでtritonでの処理は > したほうがいいと思います。 > > > tritonX-100による膜透過性処理は細胞内のタンパク質をターゲットとするもので染色したので行いました。 私はこの意見に反対はしません。非常にリースナブルな選択だと思います。でも、現状細胞質のかなりのものが処理しなくてもそまりますので、ちょっとコメントさせてもらいました。 アクチンが不安定であるとかいう理由で若干の溶出溶解が影響して、なにか見にくくしているとかそういう可能性がないかなというかんぐりもしています。特にアクチンは非常に豊富なたんぱく質ですしちょっとした拡散でイメージが大きく変わるという可能性も少し考えています。たしかにこの辺は専門ではないので判断は質問者や経験者に譲ることにします。 あと、アクチンの骨格を安定化させるような処理があれば、納得行くかなぁとも思います。 質問に感想(回答でない)を投げかけながら勉強させてもらってます。

(無題) 削除/引用 No.1182-7 - 2008/05/23 (金) 18:54:51 - 蛍 >sea様 貴重なご意見ありがとうございます。 培養ディッシュでの形態と蛍光顕微鏡で観察した時の細胞の形態は位相差や微分干渉での明視野観察では特に違いが見られませんでした。 言い忘れてしまって申し訳ありませんが、私が通常細胞を蛍光観察する時は、35 mmdishにカバーガラスを入れてコラーゲンコートした後に、そのカバーガラス上で細胞を生やし、プレパラートにして観察を行っております。 この細胞に対する染色前処理が最適かどうかと言われますと、確かに検討すべき点は多々あると思います。 また、期待通りに染まるであろう抗原を用いての染色は残念ながら行ったことはございません。その点についても検討の余地があると思います。 sea様のアドバイスをお聞きしていて自分なりに思い当たる点は、 �@染色前処理が不適切であるということ �A細胞内構造が不安定に作られているということ（細胞の特徴？） でした。 また、今回の2つの細胞の特徴を改めてみてみると、Helaは平べったい細胞であるのに対し、問題の細胞はかなり高さを持った細胞であるということにも思い当たりました。 蛍光顕微鏡による観察の仕方にも問題があるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1182-6 - 2008/05/23 (金) 16:31:47 - sea actinがしっかり染まらない、という状況に遭遇したことがないので 具体的な解決策につながらないかもしれませんが、 いくら細胞のturn overが早くても、actinがそまらない、 ということはやっぱりなんか違和感があります。 私はどちらかというと染色の際の処理による細胞骨格の変化が あるんじゃないのかな、という印象を持っています。 固定-> 透過処理-> 洗浄-> 染色 などという処理が細胞に与える負荷が大きい場合があります。 特に 「通常の培養条件と蛍光顕微鏡で観察する時の培養条件は特に変化させてはいません。」 ということは、細胞は通常の培養ディッシュの上にはえて いるわけですよね？ 私の使っている細胞は培養ディッシュ上で培養して、それを固定して そのまま顕微鏡で見ようとすると細胞がディッシュ上にくっついて いられずに辺縁からはがれてきてしまいます。 そんな細胞もいるので、蛍さんの場合も似たようなことが 起こっていたりするのでは？と思いました。 通常の培養中の状態と、染色のために固定・洗浄・染色を経た細胞では、 単純な形態は特に違いが見られませんか？ その場合には、そもそも細胞染色のための前処理が、この細胞用に 最適化されていない、ということがいえるかもしれません。 ほかに期待通りにきっちり染まるはずの抗原とか細胞特異的マーカー とかはうまく染まっていますか？ あと全く違う可能性として、確かにactinの染まり方や発現量に 異なる細胞間で差があることは不思議ではないのですが、 培養ディッシュ上で染色しているとなると、発現が弱い細胞では 観察自体が困難な可能性もあるのかな、と思いました。 (ガラスよりもプラスチックの方が乱反射とかが多いので)

(無題) 削除/引用 No.1182-5 - 2008/05/22 (木) 19:47:29 - 蛍 >sea様 ご意見、アドバイスありがとうございます。 通常の培養条件と蛍光顕微鏡で観察する時の培養条件は特に変化させてはいません。 ただ、頂いたアドバイスの中で 「特にactinが染まらない、ということは細胞骨格が正常に 形成されていない可能性がある」 という点に少し思いあたる節がありました。 私の観察していた細胞がかなり動的な性質をもったものでしたので、アクチン骨格のturnoverが早く、アクチンファイバーの形成が不十分なのかも知れません。 こうした点って考えられないでしょうか？ 質問してしまってすみません！

(無題) 削除/引用 No.1182-4 - 2008/05/22 (木) 18:22:12 - sea 私もおおさんの意見に賛成です。 HeLaが染まっている、ということは基本的に染色の系自体は 動いているわけですね。 ちなみに細胞の蛍光染色の時にはチャンバースライドとか ガラスカバースリップの上に細胞を蒔いてしばらく培養すると 思うのですが、このときの培養環境が観察しておられる細胞に 大して適切かどうか、ちょっと気になります。 特にactinが染まらない、ということは細胞骨格が正常に 形成されていない可能性があるので、なおさらです。 細胞の種類によってはこういったガラスの上では ちゃんと生えなかったり形態を維持できなかったりすることがあります。 通常の培養条件と蛍光染色用の培養条件での細胞の形態の違い、 などについてはいかがでしょうか？ ちなみにホルマリン固定でtargetが細胞内なのでtritonでの処理は したほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1182-3 - 2008/05/22 (木) 16:02:17 - 蛍 >おお様 お返事ありがとうございます。 確かに、自分としてもこの細胞での観察のし難さが細胞の状態を反映してのものなのかあるいは単に自分の行っている蛍光抗体法の条件が観察にあっていないのかと迷うところであります。 ちなみに、私は蛍光顕微鏡&デコンボリューションの組み合わせでメインに観察を行っております。また共焦点顕微鏡での観察を行ったこともあるのですが、やはり結果はイマイチというものでした。 tritonX-100による膜透過性処理は細胞内のタンパク質をターゲットとするもので染色したので行いました。

(無題) 削除/引用 No.1182-2 - 2008/05/22 (木) 15:17:35 - おお > 染色の結果より、細胞によって蛍光抗体法の条件を変えるべきかと考えております。 ちょっとそう結論づけるには何か足らないのではないでしょうか。細胞の生理的な状態を反映している可能性を否定できますか?イメージは単なる蛍光顕微鏡ですか?コンフォーカル、デコンボリューションなどは使ってないですか?例えば細胞が接着している所にフォーカスを当てるとそこからちょっとでもファイバーが伸びているとか無いでしょうか、、、 強いていうとTRITONX100処理はいらないかもしれません。経験はありませんので、経験者のフォローがあれば助かります。

免疫染色 削除/引用 No.1182-1 - 2008/05/22 (木) 14:42:03 - 蛍 研究を始めたばかりの初心者です。 今回、私はいくつかの細胞を用いて各細胞間でのタンパク質の局在を蛍光抗体法を用いて観察しようと試みています。 最初なので、とりあえずHela細胞と結腸由来のがん細胞株をRhodamine-Phalloidinを用いて免疫染色してみました。 すると、Helaではとても綺麗なアクチンファイバーが観察されたのですが、もう片方の細胞ではぼんやりとした画像しか観察できませんでした。 繰り返し実験を行ったのですが、同じ結果になってしまいました。 【主な条件】 固定：4%ホルムアルデヒド　30 min 膜透過性処理：0.2%TritonX-100 20 min ブロッキング:3%BSA/PBS 1 h Rhodamine-Phalloidin：市販製品のプロトコールに準ずる 染色の結果より、細胞によって蛍光抗体法の条件を変えるべきかと考えております。 この際、特に検討すべき条件はどこなのでしょう？？ 同様の経験をお持ちの方いらっしゃいましたら、ご教授いただけたらと思います。 よろしくお願いします。

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