Bio Technical フォーラム

  • 書き込みがかなり増えてしまいサーバーの負荷が大きくなったので、新しいBioTechnicalフォーラムに移行してください。
  • 新しいトピックは新フォーラムでのみ立ち上げ可能です。レスは2009年2月15日までつけられますが、その後は、つけられません。

トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

最新のフォーラム　|　このフォーラム（readのみ）　|　ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

MUC5AC トピック削除
No.1188-TOPIC - 2008/05/23 (金) 01:12:41 - H
ヒト気道上皮細胞のcell lysateをRIPAバッファーで調整し、ウェスタンブロッティングでMUC5ACの発現量を確認しました。ところが、目的のサイズ（130kDa付近）にそれらしきバンドが検出されません。ポンソーで泳動はうあくいっていることを確認してます。
おそらく、抗体が悪いのか、もしくはウェスタンの方法に何か工夫が必要なのでしょうか？どなたか、MUC5ACのバンドをウェスタンブロットで検出した経験のある方がおられましたら、その条件（抗体など）をおしえていただけないでしょうか？

ちなみに、私のプロトコールですが、
細胞⇒lysis（RIPA buf＜with protease inhibitor＞）⇒SDSサンプルバッファーで95℃5minインキュベーション⇒SDS-PAGE⇒WB⇒blocking⇒1次抗体（anti-MUC5AC（abcam社製品）；catlog# ab24070）⇒2次抗体⇒化学発光・・・（ちなみに2次抗体はきちんとワークしてます!!）

どうぞ宜しくお願いいたします。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.1188-6 - 2008/05/28 (水) 17:53:14 - L
・SDS-PAGE後、CBB染色して、十分な太さのバンドを得るのに必要なサンプル量を確認する。
・全く同じ条件で、SDS-PAGEして、Blotする。blot後、メンブレンをポンソーで染色することと、blot後のSDS-PAGEゲルをCBBで染めてみる。
正しくblotされたなら、CBB染色では、ゲルにはバンドがなく、メンブレンにはバンドが確認できるはず

blotの確認はこれぐらいです。
もし正しくblotされていないのならば、泳動時間を長くすることや、blot bufferのSDS濃度を振ってみることが必要かと思います。

(無題) 削除/引用
No.1188-5 - 2008/05/24 (土) 09:50:09 - qq
何の解決にもなりませんが、抗体のメーカーは、
Gastric Mucin 5AC antigen is found in columnar mucus cells of surface gastric epithelium and in goblet cells of the fetal and precancerous colon but not in normal colon.
と言っています。
ポジコン（胃粘膜上皮）でも出ないのですか？？
メーカーに聞くのが一番のように思います。

(無題) 削除/引用
No.1188-4 - 2008/05/23 (金) 16:52:42 - おお
ほぼ確実にバンドが期待できるポジコンがあれば、条件の検討がしやすいですね。抽出条件などもいろいろ文献を当たって調べてみてもいいかもしれません。というのはRIPAは比較的強い溶出条件でほぼすべてのタンパクを溶出しますが、TRITONXー100やNPー40だけで膜は完全に溶解できますが、生理的な塩濃度では可也の核内のタンパクを溶出できません。ですから溶出した総タンパクにたいするあなたのターゲットのりょうが増えるので同じタンパク量載せてもターゲットの量がおおくなり検出に有利です。

あとは煮沸(90度以上のしょり)であグッてしまうタンパクもあるようなので、サンプルバッファーを加えたサンプルを50ー60度ぐらいで一度インキュベートしてあプライしてみるのもてかもしれません(PAGE、トランスファーがうまくいっていたらという条件付ですが)。
あと、膜をニトロセルロースから、PVDFにしたらうまく行ったというのを同じラボのポスドクが経験しています。膜を変えてみるのもてかなとも思っています。

(無題) 削除/引用
No.1188-3 - 2008/05/23 (金) 10:59:56 - 通りすがり
APさんの述べられている通り、かなり分子量が大きいタンパクです。

Blottingがうまくいっているか、CBB染色などで確かめられたでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1188-2 - 2008/05/23 (金) 09:01:02 - AP
＞ところが、目的のサイズ（130kDa付近）にそれらしきバンドが検出されません。

かなり大きいですから、転写効率が悪くて検出できないのかもしれません。
糖鎖がついて、実際はさらに大きいのかもしれないと想像しますが、文献やメーカーの実験例でWesternの写真がありますか、あればやはり130 kDにでているのでしょうか。もちろん、抗体はメーカーがWestermに使用可であるとしているものですよね。

高分子量の転写効率を上げる工夫をしてみるのがひとつかなと思いますが、
転写の方法（wet or dry?)、条件、バッファー等はどんなんでしょう。

MUC5AC 削除/引用
No.1188-1 - 2008/05/23 (金) 01:12:41 - H
ヒト気道上皮細胞のcell lysateをRIPAバッファーで調整し、ウェスタンブロッティングでMUC5ACの発現量を確認しました。ところが、目的のサイズ（130kDa付近）にそれらしきバンドが検出されません。ポンソーで泳動はうあくいっていることを確認してます。
おそらく、抗体が悪いのか、もしくはウェスタンの方法に何か工夫が必要なのでしょうか？どなたか、MUC5ACのバンドをウェスタンブロットで検出した経験のある方がおられましたら、その条件（抗体など）をおしえていただけないでしょうか？

ちなみに、私のプロトコールですが、
細胞⇒lysis（RIPA buf＜with protease inhibitor＞）⇒SDSサンプルバッファーで95℃5minインキュベーション⇒SDS-PAGE⇒WB⇒blocking⇒1次抗体（anti-MUC5AC（abcam社製品）；catlog# ab24070）⇒2次抗体⇒化学発光・・・（ちなみに2次抗体はきちんとワークしてます!!）

どうぞ宜しくお願いいたします。
全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を