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(無題) 削除/引用 No.1189-5 - 2008/05/25 (日) 20:33:57 - ＴＸ おおさん ありがとうございました。 参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.1189-4 - 2008/05/24 (土) 00:55:27 - おお 確かに複数入っている可能性があるので、それを気に止めながらやるというのがいいと思います。厳密に1つにすると言うよりは、大腸菌で拾って拾えてきたクローンをイーストに入れ直してそのクローンが本当のクローンかどうか確かめる。また、ポジのクローンをもう一度プレートにストリーキングしてから、複数のクローンでプラスミドを取るなどの方法が簡単に取れる完ぺきでない方法です。 わたしは複数のクローンが入っていると言う場合それに意味があるかもしれないとも思ったりします。非常にまれな例でしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.1189-3 - 2008/05/23 (金) 19:22:02 - TX 弘法さん ありがとうございます。 preyプラスドのインサートチェックは、 insertを挟んだprey特異的な配列をprimerに用いて、 コロニーPCRしています。

(無題) 削除/引用 No.1189-2 - 2008/05/23 (金) 19:11:50 - 弘法 不和合性というより、大腸菌に回収してそれぞれのプラスミドをクローン化するのが通常の方法だと思います。仰るように解析するコロニーは２倍になりますが、最初の酵母の形質転換が適正な条件で行われていたら、複数のプラスミドを持つ形質転換体の頻度は一割程度でしょう。 酵母の形質転換の頻度が十分に高ければ、大腸菌に回収する代わりに直接酵母を形質転換することも可能です。そうして得られた形質転換体に含まれるプラスミドはきっとシングルクローンでしょう。 ところで、複数のプラスミドが入っているかどうかはPCRでチェックするんですか？

酵母プラスミドのシングル化 削除/引用 No.1189-1 - 2008/05/23 (金) 17:06:40 - ＴＸ two-hybridの候補クローンに１種類以上のprey plasmidが存在したとき、 plasmidをシングル化するベストな方法を知りたいです。 以前、two-hybirdしたときはclontechのマニュアルどおりに、 -Leu/-trp/x-a-galに数回restreakしてシングル化したのですが、 かなり時間をようしました。 いろいろ見ていると、大腸菌の不和合性？を利用して シングル化する方法もあるようですが,これだとどちらが 本物か分からないため、解析するコロニーが2倍に なるということですよね。

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