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(無題) 削除/引用 No.1193-8 - 2008/05/26 (月) 06:59:29 - SI 以前いたラボでC2C12は使っていましたが、収量が少なすぎると感じたことはなかったです。確かに組織でみると、肝臓なんかに比べれば同じ重量でも筋のほうが取れてくる量は少ないですが。 どなたかが言うように乾燥しすぎはやはり良くないです。 あとは、細胞はきちんとdishからはがせているでしょうか？たとえば、dishをPBSでwashし、そこへ直接ISOGENなどをいれて細胞を溶解しているとすると、結構核が残ってしまうことがあります（顕微鏡で確認すればすぐわかります）。 RNAを取り、RT-PCRに回すだけであれば、個人的には24-well plateの1 wellからでも十分量とれると思います。 頑張ってください

(無題) 削除/引用 No.1193-7 - 2008/05/24 (土) 14:51:40 - おお > この１μｇ/μＬの濃度に達しない・ギリギリにしか達していないsampleが多いため、今回こちらで相談させていただきました。 収量が低いので溶かす時の水の量を減らして最終濃度がそろうようにするか、もう一度エタチンして濃度が合うようにとかし直すか、RTの時に使うRNA量を低いなりにそろえるかすれば、RNAが壊れてない限りさほど問題にならないと思います。PCRでの解析と言う事なのでRTの反応に100ngぐらいあれば大抵のものは検出できると思います。250-500ngを一回に使えば十分じゃないでしょうか。ほかのサンプルをもう1ugでやっているのであれば、溶液の量を半分にして500ngつかい、なるべく条件をそろえるとかでもいいかもしれません。 >C2C12はHeLaなどと比べるとRNAが取れる量はかなり少なかったです。 >(たしか同じ面積のdishで1/10位？) " ~ "さんのコメントを考慮に入れると 収量が低いということですが10ug以上は取れていませんか?

(無題) 削除/引用 No.1193-6 - 2008/05/24 (土) 14:04:02 - ひまわり saoさん http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/15596018%20pps%20Trizol%20Reagent%20061207.pdf ここの一部を抜粋して以下に示しておきます。 RNA Isolation Notes: 1. Isolation of RNA from small quantities of tissue (1 to 10 mg) or Cell (102 to 104) Samples: Add 800 μl of TRIZOL® to the tissue or cells. Following sample lysis, add chloroform and proceed with the phase separation as described in step 2. Prior to precipitating the RNA with isopropyl alcohol, add 5-10 μg 　→　RNase-free glycogen (Cat. No 10814)　← as carrier to the aqueous phase. To reduce viscosity, shear the genomic DNA with 2 passes through a 26 gauge needle prior to chloroform addition. The glycogen remains in the aqueous phase and is co-precipitated with the RNA. It does not inhibit first-strand synthesis at concentrations up to 4 mg/ml and does not inhibit PCR. glycogenを使って落としやすくするのはよくやられるみたいです。 僕のlabはお金がないのでやりませんが。。

(無題) 削除/引用 No.1193-5 - 2008/05/24 (土) 13:34:43 - sao みなさま早速のご返答ありがとうございます。 >~さん そこまで少なくなるものなのですね。驚きました。 dish１枚を１sample分としていたのですが、数枚分を１sampleとした方が良さそうですね。 今まで濃度が低いから・・・という理由で破棄してしまってましたが、 今後はちゃんとＲＴかけて泳動してみることにします。 >ゆうちゃんさん グリコーゲンですか？？ よろしければ何故収量が良くなるのかご存知でしたら教えてください。 風乾させすぎ・・・もあるかもしれません。 気をつけるようにいたします。 >おおさん おおさんが仰る電気泳動装置は研究室に置いてありませんが sampleは破棄せずに泳動、確認を行なってみます。 説明不足、失礼いたしました。 細胞数はカウントしていないのですが、10ｃｍdishに対して約９割コンフルエントの細胞を回収し、それを１sampleといたしました。 現在の研究室のプロトコールに従うと、ＲＮＡ回収・溶解後の溶液の濃度を１μｇ/μＬにしてからＲＴにかけ、ＰＣＲ・電気泳動し、各種遺伝子の変動を見ることを目的としています。 この１μｇ/μＬの濃度に達しない・ギリギリにしか達していないsampleが多いため、今回こちらで相談させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.1193-4 - 2008/05/24 (土) 09:42:45 - おお 例えば骨格筋はからRNAを取った場合は結構収量は少ない(たの組織に比べ)と言っていた人がいました。きっと培養細胞でもそうなのかもしれませんね。ほかの方もおっしゃってますが、RNAを得たあと一度電気へいどうでrRNAがインタクトであるか確かめるべきです。通常の電気えいどうのかわりにアジレント社のキャピラリー電気エイどう装置(バイオアナライザー)なども使えると思います。 収量が低いということですが、どれくらいの 細胞のスケールでどれくらいの収量が得られたのか、でどの程度の収量が必要と思っているのか、どういうふうに使おうとしているのかを書いた方が、得られる情報が多いと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.1193-3 - 2008/05/24 (土) 02:28:37 - ゆうちゃん 元々の細胞数がそこまでない場合にはグリコーゲンなどの多糖を加えるといいですよ。 もちろんRNAase freeでなければいけませんが。 それからRNAのペレットは乾かしすぎるとかなり水に溶けにくくなります。 ちゃんとペレットはあっても乾燥しすぎてしまった際に、何度もピペッティングを行いますが 不溶性のためチップの内壁にペレットが張り付いてしまいどうしようもなくなったことが何度かあります。エタチン後の乾燥は15 minくらいでもOKかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1193-2 - 2008/05/24 (土) 00:11:12 - ~ C2C12はHeLaなどと比べるとRNAが取れる量はかなり少なかったです。 (たしか同じ面積のdishで1/10位？) 取れているものがちゃんとしているかどうかが大事でしょうから、 電気泳動してみて、rRNAのバンドが見えるか確認されてはいかがでしょうか。 それほど時間をかけなくてもシャーレの枚数を10倍にすることはできると思います。

Ｃ２Ｃ１２のＲＮＡ抽出について 削除/引用 No.1193-1 - 2008/05/23 (金) 23:42:21 - sao こんばんは。 私は４月になってから実験を始めたばかりの学生です。 初歩的な質問でトピを立ててしまって申し訳ないですが、皆様の知恵をお貸しください。 私は、マウス由来筋芽細胞株のＣ２Ｃ１２を用いた実験を行なっています。 筋管に分化した細胞を回収しＲＮＡ抽出を行なったのですが ＲＮＡ量が十分に取れません。 抽出方法としてはＩＳＯＧＥＮを用いたプロトコールに従っています。 ＲＮＡを風乾させたのち ＴＥとＤＥＰＣ処理水で溶解させ、 その一部をＤＥＰＣ処理水で希釈して吸光度を測定し、ＲＮＡ濃度を算出しています。 ＯＤ２６０/２８０は２付近の値になるのですが、吸光度自体がとても低く ＲＮＡ量が非常に少ないため困っています。 ちなみに回収した細胞は見た目十分量あるかと思います。 私なりに原因を考えてみたのですが �@ＤＥＰＣ処理水に問題がある �AＲＮＡの風乾もしくは溶解が不十分 �BＣ２Ｃ１２で回収できるＲＮＡがもともと少ない 私の浅い知恵ではあまり思いつきませんでした。 これから病院での実習も始まり、あまり実験に時間をあてることができなくなってしまいますが、何かお気づきの点・アドバイス等ありましたら宜しくお願い致します。

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