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(無題) 削除/引用 No.1194-3 - 2008/05/25 (日) 02:42:32 - おお ている理由がよくわかりませんが… > > >感度の問題などあるのでしょうか。 > はっきりいって悪いです。 なるほど、私も感度を気にしてました。そういう予感はあったのですが、参考になりますね。 で、IgG L鎖で作った2次抗体があります。 実際使ったことはないですが最近ラボで購入し周りの人が使い始めてますが、良好です(感度についてはまだ私個人で使ってないので、、IPする実験がここしばらくなかったので分かりませんが)。目的のタンパクがそこそこ大きければ40KDa以上であれば邪魔はしません(35あたりでも大丈夫だと思います)。IgGL鎖の抗体は血清中の最も多くあるサブタイプを抗原にして作っています。モノクロならサブタイプを気にしないといけないかもしれません。ポリクロだと大丈夫だろうとおもいます。この辺も使用感はありませんので、気に止めておいた方がいいという程度です。 今回は同じ種由来の幾つかの抗体をIP、IB兼用の抗体を用意してIPでもIBでもおなじ2次抗体をつかって、最小限の抗体の購入と考えているようですね。IgG L鎖の抗体で何とかなるのならとりあえずそれでスタートしていいかと思います。しかし、IPを研究室で行いう機会がその後もあるなら、一筋縄ではいかなくなってくると思います。IPに適する抗体、IBに適する抗体目的のコンプレックスの状態、手に入るベストの抗体の種など考えると、おのずとバリエーションが増えてくると思います(無理に増やす必要はないですが)。ですから、今回の次の購入は違い種の抗体と、それに対する2次抗体になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1194-2 - 2008/05/24 (土) 18:05:07 - ~ ＞その抗体でIPとIBを行ったあと、二次抗体をnative Igだけを認識するものを購入すれば、IPのtargetが別の場合にでも応用可能なのかな IPとIBを同じ抗体で行った後で、IPのターゲットが別というのがどういう状態を指しているのかよくわかりませんが、 IPの抗体と、WBの抗体の標的が別でco-IPをしたいということでしょうか？ そうであれば、IP時の抗体のSS結合が切られているために認識されないという、 応用ではなく、標準的な使い方です。 >もしくはIPの際に用いる抗体と、抗体産生の種を変えて、IBの際に用いる抗体でIBした方が良いのでしょうか nativeの抗体を認識しない二次抗体を使うのに、IP時の抗体のホストを気にされている理由がよくわかりませんが… >感度の問題などあるのでしょうか。 はっきりいって悪いです。 ただ、IPする以上、濃縮できますよね。 Whole lysate でシグナルが弱いか、見えない場合でも、 IP後にはTrueblotで見えるということはよくありました。 Co-IPでtrueblotを使ったことが無いのですが、効率しだいでは見えるようになるのかもしれません。

IgHやIgLに反応しない二次抗体について 削除/引用 No.1194-1 - 2008/05/24 (土) 08:03:46 - ひまわり おはようございます。 いつも勉強させていただいています。 大変初歩的な質問でトピを立ててしまい申し訳ありません。 よくBio technical forum内で免疫沈降に使える抗体でIPした後に、別の種から得られた抗体でimmunoblotを行いますが、IgHやIgLに二次抗体が結合しないよう注意を払いますが、もしそういったバンドが出てしまった際にはnative抗体だけを認識する二次抗体でdetectすれば問題ないとここで勉強させていただきました。 今後、私も免疫沈降をする予定なのですが、従来まではIP用とIB用の２種類の同一抗原を認識する抗体を同時に購入していたのですが、研究費削減のため、IPとIBがどちらもできる抗体をひとつ購入してしまって、その抗体でIPとIBを行ったあと、二次抗体をnative Igだけを認識するものを購入すれば、IPのtargetが別の場合にでも応用可能なのかな、、と素人的に思います。このような理解で良いのでしょうか。 もしくはIPの際に用いる抗体と、抗体産生の種を変えて、IBの際に用いる抗体でIBした方が良いのでしょうか。native Igだけど認識する二次抗体は、通常のwhole IgG免疫原として作製した二次抗体に比べ、感度の問題などあるのでしょうか。 大変初歩的な質問で申し訳ありません。 金銭的に制限されている研究室ですので、もしIP/IBの際に抗体が一種類で足りるのであれば教授もGOサインを出してくれるのでは、、とふと考えました。もちろんそのためにはここで勉強させていただいたnative 抗体だけを認識する二次抗体をひとつ購入して行かなければなりませんが、他の抗原でIPした際にも応用可能なのであれば教授にかけあってみようかなと思っています。 長文で大変申し訳ありません。 何かアドバイスをいただければ幸いです。宜しくお願い致します。

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