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(無題) 削除/引用 No.1201-4 - 2008/05/28 (水) 05:46:33 - おお そうそう糖修飾などの必要性も考慮しないといけないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1201-3 - 2008/05/28 (水) 05:44:57 - おお >[Re:1] UKさんは書きました : > 　タンパク精製についてくわしくないのですが、大腸菌で発現させるとRefoldingが必要なタンパクも、酵母で発現させればRefoldingの手間が省けると聞いたのですが、これは正しいのでしょうか？ そうとも限らないと思います。 イーストで発現させても、可溶性が低ければ変性作用の強い物を使わざる終えませんし、大腸菌より遥かに収量が低くなる可能性もあります。酵母はどんな系をお考えでしょうか?それを示すことで、もっと情報が得られると思いますが、、、 > > 　また、GFP標識タンパクを精製させるためには、Hisなどのタンパク精製に必要なTagを付ける必要があるのでしょうか？ HISなどをつけると精製が容易になるとはいえると思いますが、必要とは一概にいえません。あなたの研究室がタンパク精製に対してノウハウをもっていて、だれかがある程度の頻度で精製をしているのであれば(例えばFPLCのシステムがワークしているとかイオン交換のカラムを使っているとか)、なくても精製は可能です。これはどれくらいタンパクが得られるかなどによっても選択が変わる可能性があると思います。

(無題) 削除/引用 No.1201-2 - 2008/05/27 (火) 23:26:18 - A >タンパク精製についてくわしくないのですが、大腸菌で発現させると>Refoldingが必要なタンパクも、酵母で発現させればRefoldingの手間が >省けると聞いたのですが、これは正しいのでしょうか？ 蛋白質を大腸菌を使って発現させる場合 １．目的の蛋白質が発現し上清から回収できる。 ２．目的の蛋白質が発現するものの封入体中に発現される。 ３．目的の蛋白質が発現されない。 が一般的なパターンです。２や３になるのは大腸菌にとって毒性の 強い蛋白質（例えばプロテアーゼやヌクレアーゼなど）で見られる 場合が多いようです。毒性の強い蛋白質の場合、誘導しなくても 幾らか発現されてしまいそれによって大腸菌が全く発現しない 場合もあります。 手間が省けるという理由で酵母の系を使うのはあまり良い選択では ないと思います。酵母の発現系をつくるのは大腸菌に比べ手間がかかり ますし大腸菌なら前培養を含め2日で蛋白質発現を終わらせられるの が一般的なのに酵母は前培養などを含め1週間ぐらいかかるのが普通 ですから。 目的蛋白質が封入体中に発現されてしまうとRefoldingが手間になる というアドバイスを誰かから受けたようですがその場合、 １．封入体中の蛋白質の80%以上は目的蛋白質で粗精製サンプルで 　　必要十分であればRefoldingだけで精製する必要が無い ２．分解されやすい不安定な蛋白質を発現させても封入体中に発現されれ 　　ばプロテアーゼなどによる分解を受けない のようなメリットもありますから封入体中に発現されるのが一概に 悪いとは言えません。 以前ある蛋白質を発現させることになった時は大腸菌と酵母の発現系を 同時に構築し発現検討を行いました。その時は既に目的蛋白質が 大腸菌にとって有害であろうことが予想できましたから、大腸菌の 発現条件については一般的な範囲で行って諦め、後は酵母の系に 集中しました。 >また、GFP標識タンパクを精製させるためには、Hisなどのタンパク >精製に必要なTagを付ける必要があるのでしょうか？ これは使われる実験系によって異なりますからなんともいえません。 もちろんTagがあれば精製は楽になるでしょうが例えばネガティブ コントロールとしてGFP標識タンパクとTagだけの別の蛋白質を準備 する必要が出てくるかもしれません。これについてはここで聞くのでは なく状況を詳しく話すことの出来る研究室の先輩なり指導教官と良く 話し合った上で決めるべきでしょう。

GFP標識タンパクの精製方法 削除/引用 No.1201-1 - 2008/05/27 (火) 22:17:22 - UK 今回目的のタンパクAのN末にGFPを付けてGFP標識タンパクの精製をしたいと思っています。 　タンパク精製についてくわしくないのですが、大腸菌で発現させるとRefoldingが必要なタンパクも、酵母で発現させればRefoldingの手間が省けると聞いたのですが、これは正しいのでしょうか？ 　また、GFP標識タンパクを精製させるためには、Hisなどのタンパク精製に必要なTagを付ける必要があるのでしょうか？ 　ご教示お願いします。

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