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アクチン、微小管染色 トピック削除
No.1202-TOPIC - 2008/05/28 (水) 00:33:39 - maru
実験を始めたばかりのものです。よろしくお願いします。
私はプロジェクトの導入として、分散培養した神経海馬細胞で
成長円錐を観察したいと考えています。
PLLコートしたカバースリップ上にまいたDIV2−3の細胞を
37度PFA3.7%15分、50mM NH4Cl15分、10%horse serum,0.1%tritonで処理した後 抗β-tublin抗体、Phalloidinで染色しています。
フィロポディアのような構造は見られるのですが、ラメリポディア
様構造が観察できません。研究室の前にいらした方はうまくいっていたのですが。
染色の全処理段階で何か問題があるのではと考えています。
何か、ご指摘いただけないでしょうか。
 
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(無題) 削除/引用
No.1202-2 - 2008/05/28 (水) 23:18:01 - マイオスタチン
前任者がうまくいってたのなら、どこかの工程でerrorが生じていますよね。

PFAでの処理は室温でも良いと思いますよ。
PFAを溶解(加熱してアルカリ溶液を加えてますよね)した後、室温でも十分に力価はありますし、37度にしているつもりが温度が高すぎて脱重合が心配ですし。

後は、ちゃんと抗体が目的のsample上部にapplyできてるかじゃないですかね。

アクチン、微小管染色 削除/引用
No.1202-1 - 2008/05/28 (水) 00:33:39 - maru
実験を始めたばかりのものです。よろしくお願いします。
私はプロジェクトの導入として、分散培養した神経海馬細胞で
成長円錐を観察したいと考えています。
PLLコートしたカバースリップ上にまいたDIV2−3の細胞を
37度PFA3.7%15分、50mM NH4Cl15分、10%horse serum,0.1%tritonで処理した後 抗β-tublin抗体、Phalloidinで染色しています。
フィロポディアのような構造は見られるのですが、ラメリポディア
様構造が観察できません。研究室の前にいらした方はうまくいっていたのですが。
染色の全処理段階で何か問題があるのではと考えています。
何か、ご指摘いただけないでしょうか。

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