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リン酸化のウエスタン トピック削除
No.1212-TOPIC - 2008/05/28 (水) 19:38:23 - IK
IkappaBのリン酸化をウエスタンでみようと思っております。
リン酸化のシグナリングをみる場合は、普通のウエスタンで用いるサンプルバッファーではなく、リン酸化用のサンプルバッファーなどを用いたほうがよいのでしょうか?
また、どれが良いとかありますでしょうか
 
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No.1212-9 - 2008/05/29 (木) 20:22:34 - IK
ありがとうございます。
スキムミルクで行ってみます。

リン酸化阻害剤は用いられておられますか?
私は、培養細胞の生えたフラスコにそのままSDSPAGE用サンプルバッファーを加えて回収し、泳動しますので、用いなくてもいいかなとおもっているのですが。いかがでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.1212-8 - 2008/05/29 (木) 19:45:38 - スキムミルク
僕らのグループでは特異的なリン酸化抗体であればスキムミルクを用いています。
全く問題ありません。

IKさんはIkBのsite specificなリン酸化抗体を用いるのですよね?
ならばスキムミルクで全然OKですよ。

ただ、4G10とかPY20とかPY100とかいうチロシンリン酸化抗体のように抗体の標的がいくつもある場合にはスキムに含まれるリン酸化カゼインにも反応してしまいます。

ですが、IkBの何番目のチロシンを認識するリン酸化抗体を用いるのであれば、BSAなど使う必要なく、スキムでOKです。

(無題) 削除/引用
No.1212-7 - 2008/05/29 (木) 09:29:53 - thyna
スキムミルクに含まれるカゼインが高度にリン酸化されているために、リン酸化抗体がこれらを認識してしまい、結果として特異的なバンドが得られない。というのが一般的な解釈です。 ただ一度試してもらえれば!なのですが、雪印が販売している普通のスキムミルクは「なぜか」実験用のスキムミルクとは違ってリン酸化抗体でも問題なくBlotできますよ♪(検討済み)

http://www.snowbrand.co.jp/products/c_milk/03/index.html

ありがとうございます。 削除/引用
No.1212-6 - 2008/05/29 (木) 08:40:40 - IK
今までは、ウエスタンでは、培養細胞を刺激したあと、PBSでwashし、Santacruz社のElectrophoresis Sample Buffer(sc-24945:contains glycerol, TCEP, DTT, SDS, 1.0M Tris-HCl pH 6.7 and bromophenol blue)をdishに加え、細胞を回収し、電気泳動していました。

今回も同様に、細胞をTNFで刺激し、リン酸化IkappaBが増えるかどうがをウエスタンで検出しようと思っております。
プロダクトシートでは、フォスファターぜなどの阻害剤を加るようには書いていませんでした。しかし、論文では加えていることが多いように思えます。


CBBさん>ブロッキング溶液のみ、スキムミルク以外を使う他はフツーです

スキムミルクでは、どうしてだめなのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.1212-5 - 2008/05/29 (木) 02:49:16 - おお
フォスファターぜなどの阻害剤が入っているかということでしょうか?
実際にどの商品とか、バッファーの組成とかがないと具体的なことが分かりません。

同時にサンプルをどのようにちょうせいするかと言うのにも依存するかと思います。
細胞や組織などをいきなりSDSPAGE用サンプルバッファーに溶解するならあまり気にしないでいいと思いますが、念のためにフォスファターぜの阻害剤を加える方もいると思います。

SDSPAGE用サンプルバッファーと混ぜる前に、細胞をほかのバッファーで溶解する場合溶解するバッファーにフォスファターぜ阻害剤と加えてキナーゼ阻害剤を入れるのが一般的です。その場合はSDSPAGE用サンプルバッファーは別に特別なものを使わなくていいと思います。

実験の系を示していませんので、私の誤解があるかもしれませんので、差支えのない範囲でもう少し情報を提供する方が、的確なアドバイスが得られやすいと思います。

基本的に 削除/引用
No.1212-4 - 2008/05/29 (木) 01:49:45 - cbb
ブロッキング溶液のみ、スキムミルク以外を使う他はフツーです。
(電気泳動前のサンプル調製段階でのフォスファターゼインヒビターは当然ですが。。。)

(無題) 削除/引用
No.1212-2 - 2008/05/28 (水) 22:55:56 - ami
どうやってみるつもりなのか分からないのでなんとも言えません(リン酸化IkappaBを認識する抗体を使うのか、免疫沈降して抗リン酸化なんたら抗体を使うのか)。

基本的にはプロダクトシートに書いてあるとおりにやればいいのではないでしょうか

リン酸化のウエスタン 削除/引用
No.1212-1 - 2008/05/28 (水) 19:38:23 - IK
IkappaBのリン酸化をウエスタンでみようと思っております。
リン酸化のシグナリングをみる場合は、普通のウエスタンで用いるサンプルバッファーではなく、リン酸化用のサンプルバッファーなどを用いたほうがよいのでしょうか?
また、どれが良いとかありますでしょうか

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