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(無題) 削除/引用 No.1279-8 - 2008/06/11 (水) 10:28:46 - 名無し 膜を水で１５分くらい洗ってから、6M Gdn-HCl, 50mM Tris-HCl, 5% bME (pH6.7)の溶液中で室温で30分〜45分くらい震盪する（bMEなしの溶液まとめて作っておいて、使うときにbME入れる方がさらにいいかもしれない、やってないけど。）。そのあと多めの水で２０分X４〜５回くらい洗う。（回数３回くらいのして時間延ばしてもOK,この辺は適当。大事なのは十分に洗う事。不十分だとバックが変な風に汚くなった事があるので。）あとは普通のWestern blotting.　これでリプローブ２回くらいはたいていいける（１回目と大差ないということ）。３回以上はやったことないので知らないけど、５回いけたと言ってる人いた。たまにだけど抗体によってはリプローブするとバックがすごい上がるものあるけどだいたいは問題ない。低分子量蛋白質（10~15KDaくらい)はリプローブしてからの膜だとシグナルが薄くボヤっとなることがあった。この辺はケースバイケース。 経験では膜は乾かさない方いい気がする。すぐにリプローブしないときは１回目のWBのあと水で洗ってから水に入れて4Cで保存。（少なくとも３、４日はOKだった。）

(無題) 削除/引用 No.1279-7 - 2008/06/09 (月) 11:41:42 - おお > > おおさまのおっしゃられた０．２Ｎ　ＮａＯＨでincubateする際には加温するのでしょうか？またpH2以下のグリシンの場合にも同じように加温するのでしょうか？この時のグリシン濃度を教えていただけるとうれしいです。 > また０．２Ｎ　ＮａＯＨの濃度も教えてくださいませんでしょうか。よろしくお願いいたします。 両方とも加温はしていません。グリシンはプロトコールは見ておらず手前味噌で100mMでやってます。量が多い方がpH的にはあんていにたもてるという感じで多めにというのが100mMが意味するところです。250mMと上げればそっちのほうがいいのではと言われると、そうかもしれませんが裏を取ったわけでもないので、結論をもっていません。 0.2N NaOHのNは規定度のNなので、0.2Mと言う事です。

(無題) 削除/引用 No.1279-6 - 2008/06/08 (日) 18:23:11 - 小早川 みなさま 情報ありがとうございます。参考にさせていただきます。 情報が少なくてすみません。 私はニトロセルロース膜ではなく、PVDF膜からはがそうと思っております。 おおさまのおっしゃられた０．２Ｎ　ＮａＯＨでincubateする際には加温するのでしょうか？またpH2以下のグリシンの場合にも同じように加温するのでしょうか？この時のグリシン濃度を教えていただけるとうれしいです。 また０．２Ｎ　ＮａＯＨの濃度も教えてくださいませんでしょうか。よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1279-5 - 2008/06/07 (土) 18:37:03 - window 私のところではami様と同じ メルカプトエタノールとSDSのバッファーでやっています。 ６０度ぐらいで一時間処理後、ブロッキングからやり直してます。 このバッファーを５０ｍｌのファルコンに作って、 使用したら凍らせて数回再利用できます。

(無題) 削除/引用 No.1279-4 - 2008/06/07 (土) 15:18:38 - おお いろいろな方法があるようです。 1)SDSと還元剤(DTTとか2-ME)を用いて、過熱する方法。これはやってた事がありますが、私の系はシグナルは確実に弱くなっていきます。 2)0.2N NaOHで10分ぐらい。この方法は強いシグナルはいくらか残ることがありましたが、比較的良好のように思えます。１度処理しているのを忘れてO/N処理になったしまったことがありましたが、ニトロセルロースはボロボロになりました。時間はちゃんと守った方がよさそうです。 3)pH2以下のグリシン-HClこれは以外とシグナルが残ります。 で最近は2)と3)の組み合わせでやっています。もし、１次抗体の種(動物)が違うなら、HRPならアザイド、APなら多分燐酸イオンで活性を潰すだけで、はがさなくても何とかなると思います。

(無題) 削除/引用 No.1279-3 - 2008/06/07 (土) 14:58:26 - 名無し 分子量が明らかに違っていて、はがす必要性がないなら無理に剥がさない方がいいと思う。面倒だし、中途半端にはずれてややこしくなるといやだし。気のせいかもしれないけどリプローブ繰り返すと、シグナルが弱くなってくるきがするし。論文によっては混ぜていっぺんにIBしてるのもたまに見かける。最初だけは別々にやって確認してるとおもうけど。

(無題) 削除/引用 No.1279-2 - 2008/06/06 (金) 23:39:19 - ami Easy Stripping Method: 1. Put the blot in the following solution: 100 mM 2-mercaptoethanol 2% SDS 62.5 mM Tris-Cl pH 6.7 2. incubate 50 degrees for 30 min. in a sealed plastic container in the shaking water bath. (this can be repeated if necessary) 3. Rinse with TBST. Can be stored at 4 degrees. 4. Reblock with TBSTM as in step 2 of Western probing method (above) before reprobing with antibody. よくわかりませんけど、GoogleでWestern blot strippingで検索すればいくつでも出てきますし、このフォーラムで検索しても出てくると思うのですが、それではいけないのでしょうか。

抗体を剥がすbufferの組成 削除/引用 No.1279-1 - 2008/06/06 (金) 23:05:33 - 小早川 いつもお世話になっております。 最近になってウエスタンブロッティングを始めました。 目的の抗体でIBしたあとに、一度抗体をはがして再度、actinの抗体で補正をしております。 ここで、質問なのですが、このストリッピングbufferの組成についてご存知の方がおられれば、ご教授くださいませんでしょうか。宜しくお願い致します。 というのもこれまでpierceのstrippiing bufferを私用していたのですが、経済的な理由から購入を控えたいという流れになっています。 私が見ようとしているbandはactinよりはるかにbandの強さで言ったら比較にならないくらい薄いのでactinでIBの際は特に剥がさなくてもいいのかなあとも思うのですが… 組成は知っておきたいので宜しくお願いします。

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