C2C12を用いたStable Cloneの作成についてアドバイスをいただきたく、こちらに投稿しました。
実験条件は以下の通りです。
Materials
Vector: pCI-neo Mammalian Expression Vector (Promega)
Cell Growth Media: 10% FBS, Pen/Strep in DMEM
Transfection Reagent: Fugene 6
Plasmid DNA amount: 5 micro-g / 100 mm dish
Antibiotics: G418 (50 mg/ml, Calbiochem)
ある遺伝子Aを発現ベクター（pCI-neo）へサブクローニングし、プラスミドを精製。
C2C12へのトランスフェクションはFugene6を使用、細胞数は100K cells / 100 mm dish、DNA量は5 micro-g / 100 mm dish。
（この条件の場合、confluencyはおよそ10%以下、発現はウェスタンで確認済、免染の結果から全細胞のうち10〜15%程度に導入されている模様）
トランスフェクションから24時間後、G418によるセレクション開始。濃度は400 micro-g / ml（後述）。以降、培地交換は３日毎。
また事前に、以下のようにG418最適濃度を決定しました。
C2C12を100K cells / 100 mm dishにて撒き（トランスフェクションは行わず）、プレーティング後２４時間目からG418を含む培地に交換。
G418濃度は1600, 800, 400, 200, 100, 50 micro-g / mlの６段階を試したところ、400 micro-g / mlが最適と判断。
（G418添加後4日目あたりで細胞が死に始め、14日以内にほぼ全ての細胞が死滅）
現在困っている点は、以下の点です
１．
DNAトランスフェクションを行った場合、C2C12のG418への耐性？が極端に増加する。細胞が死に始めるのは、セレクション開始後7〜8日目くらい。トランスフェクション効率は15％程度なので、全ての細胞がNeomycin Resistantになるとは考えにくい。この時点でConfluencyは70％程度。
２．
セレクション開始後１０日目位になると、myoblast同士が融合を始め、myotubeへと分化してしまう。分化したmyotubeはさらにNeomycin Resistanceを増すようで、全然死なない。
３．
セレクション開始後4週間くらいになると、生き残っているのは分化したmyotubeばかりで、myoblastのコロニーが得られない。
これまでG418の濃度は3200 micro-g / mlまで増やしてみましたが、この濃度でも細胞が死に始めるのは、セレクション開始後7〜8日目くらいと変化がありません。
今後の対策としては、プレーティングする細胞数を減らしてみるくらいしか思いつかないのですが、他に何か効果的な対策はありますでしょうか？
何かアドバイスをいただけたら幸いです。
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