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(無題) 削除/引用 No.1287-6 - 2008/06/10 (火) 14:45:03 - おお ちょっと思いつきましたので、追加させてもらいます。細胞内にとどまるコントロールがあれば実験としてわかり易いかと思いました。 メカニズムが分からないのでちょっと試行錯誤というのは否めないのですが、たとえば貴方のたんぱく質中央で切って、N末、C末のフラグメント(多分HAとかTagをつけるといいかと思います。両者で若干のサイズのさがあるならサイズで区別できることを確認するか、違うタグを使うか)の発現ベクターを作ります。両者を過剰発現してエンドで両者十分な発現があることを確認して、その培養上清を確認します(co-transfectionをすると同じ土俵で見ているといえるのでわかり易いかと思います)。N末に分泌に関与するアミノサン配列があるなら、N末は分泌されて、C末は分泌されないでしょうし、ウエスタンでその差を確認できるかもしれません。もしN末もC末も分泌されてないようでしたら、全長と比較実験をすればいいかと思います。全長でもN末のタグとC末のタグでどちらかが分泌メカニズムの邪魔をするかもしれませんのでそういう比較もありかと思います。たんぱく質が小さいということなので逆に大きな物をつなげてやれば分泌するかなどもやってみるといいかもしれませんね。GFPを融合して分泌されるなら、GFPだけをコントロールにして、培養上清を確認すればいいですし、分泌されないなら、タグなしと比較すれば、分泌されるものとされないもののクリアーな比較になりますのでデーターにしやすいと思います。小さいということですが実際はなんKDaぐらいなんでしょうか?半分に分けても5kDaぐらいなら何とかSDSPAGEで見れると思います。 膜をまたぐのでアルファーヘリックスがそれに関与してそうな気がしますね2次構造予測とか参考になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1287-5 - 2008/06/10 (火) 10:04:24 - ねこ アドバイスありがとうございます。 ＞おお様 LDH assayはやりました。死細胞の割合とかは見ていなかったので、見てみたいと思います。分泌刺激はかけていないんです。ただ、変異体とかで分泌減少してたらいいのかな？とは考えています。 それから元々のタンパクが小さいのでタグを付けるとそれにかなり影響されてしまうので、GFPは無理かと。免染でも全体がばーっと染まってしまうので、どこに居るかはっきり分からないのです。でもデングラして細胞内局在を見てみようと思い、実験を始めました。 ＞chase様 cellのpaper読みました。私の見ているタンパク質もサプリの表にあったので、caspase刺激とかinhibitorを使うのならすぐできそうですし、やってみようと思います。 pulse chaseは必要ですよね、やっぱり。おお様との意見とあわせると、LDH assayとの組み合わせで、time lapseで死細胞数を差っ引いたらいいのかなと考えています。それで分かるほど沢山分泌されているかが分からないですが、まずはやってみます。 糖鎖修飾されることも分かっていますが、残基まで特定されていません。おもしろそうなネタなので、分泌とは関係ないテーマとなったとしても将来の実験予定には入っています。

(無題) 削除/引用 No.1287-4 - 2008/06/10 (火) 00:47:16 - chase 文字負けしてました。Active Caspase-1 Is a Regulator of Unconventional Protein Secretion、vol132, 818-831 というCellの論文です。

(無題) 削除/引用 No.1287-3 - 2008/06/10 (火) 00:44:57 - chase たいへん難しい問題ですが、まずは古典的にpulse-chaseでkineticsを調べるのが基本ですかね。見ておられるのはおそらく微量の分泌なので、免疫染色やGFPタグでは難しいと思います。アスパラギン結合型糖鎖がつくなら、内腔側にtranslocateされてる証拠になりますし、分泌される可能性も高くなります。ただ明らかなsignal seqを持たないのなら、そういうのではない可能性が高いです。昔からnonconventional pathで分泌されるものとして有名なのがIL1やFGF2などで、死細胞から出るという話も大昔はありましたが、ようやく最近になって、caspase1が積極的にそれらの分泌に関与することを示した良い論文が出ています。Cell 132, 818–831, March 7, 2008です。これの実験方法と、彼らがやったcaspase1依存的に分泌される蛋白の表があるので、参考になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1287-2 - 2008/06/09 (月) 11:26:45 - おお こういうのって難しいですよね。完ぺきではないですけど、こういうふうな見積もサポートするのに役に立つかなと思いました。あなたの細胞をその分泌条件で細胞死の割合を見積もってみるといいかもしれません。LDHを使うとかアネキシンVおよびPIでナンパーセントぐらいの細胞が死んでいるというのを見積もるわけです。見方によりますが、がん細胞など非常にいい状態でも数%死んでいる場合がありますし、1%以下かもしれません。で死んでいる細胞の量から見積もられるエンドの量と、培養上清の収量を比較して培養上清の収量が死んでいる細胞の量から見積もられるエンドの量より非常におおいなら、分泌を介している可能性を示唆できるはずです。 刺激を介した分泌小胞であればcAMP(ジブチルcAMP)やその合成阻害剤で変化する可能性もありますね. あとは、免疫染色や、GFPなどのタグをつけて生細胞での局在などから地道に分泌経路の解明をするのも考えるべきではないかとも思います。

分泌タンパク質の細胞内成分のコンタミ 削除/引用 No.1287-1 - 2008/06/09 (月) 10:51:29 - ねこ とあるタンパク質が細胞外分泌タンパク質である可能性が出てきました。 培養液をウエスタンしたところ、はっきりとバンドが確認できたのですが、 「細胞が死んでエンドのタンパクが見えてるんじゃないの？」というコメントが出てきました。 そこで、これが細胞内成分のコンタミではないことを証明したいのですが、良い方法はないでしょうか？ ちなみにこのタンパク質には分泌シグナルなどはありませんし、自分でも付けていません。 そのためER-Golgi系での分泌経路を辿るのか分からないのですが、とりあえずブレフェルジンAで分泌阻害をかけてみようと思っています。 それ以外に何かよいアイデアがあったらお願いします。

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