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(無題) 削除/引用 No.1288-3 - 2008/06/09 (月) 13:16:13 - ats 「抗体同志による架橋」の意味がよく分かりませんが、...。 多少でも定量性を出すためには、抗原の取りこぼしがないように、抗原量＜抗体量＜担体の抗体結合容量(能力）とする必要があります。B)の場合は「抗体量＜担体の抗体結合容量」が保証されている（担体が抗体で飽和している）ので幾分わかりやすいことが利点です。A)の場合は述べられているように抗体の自由度が高いので抗原と抗体の結合（平衡状態に達する）は比較的早いことが予想されます。 ペプチド抗原でないpAbの場合、抗原に複数の抗体が結合することが予想されます。これも微量の抗原を捕捉するには有利に働くでしょう、B）の場合はおそらく1つかな？。 したがって微量の場合にはA)の方がよいと思います。 ただし、どちらの場合も、抗原量＜抗体量すなわち抗体量が飽和していること、言い換えれば抗体（担体）を増やしてもIPされる抗原量に変化がないことが（半定量性には）重要です。 ...と言っている割に、私はB)を使うことが多いです。

(無題) 削除/引用 No.1288-2 - 2008/06/09 (月) 13:15:05 - ゆい Bのやり方、担体と抗体を反応後「wash」してlysateと反応させる。 するとその担体には必ず抗体がついてる。 but　最初にlysateと抗体、その後担体のやり方。 その場合、担体には必ずしも抗体は付いていない事になる。 ってことで前者がオススメだが、実際には面倒なので、後者で私はやる。 さらにめんどいときは、lysateに抗体と担体まぜてover nightする場合もある。 まずそのpAbがIPできるか調べんとね。 てか自作なんだ。。ウサギ可哀想…

ＩＰの処理方法 削除/引用 No.1288-1 - 2008/06/09 (月) 12:48:26 - ＩＰ−ＷＢ 現在細胞抽出液から自作ウサギpAbによるIPを試みようとしております。 様々な文献を調べている中で疑問が出てまいりましたので、この場で御相談させて頂きたいと思います。 IPのプロトコルとして、2つの方法がよく見受けられます。 Ａ）ライセートと抗体を反応後、担体（Protein GもしくはＡ，抗-抗体）と反応 Ｂ）担体（Protein GもしくはＡ，抗-抗体）と抗体を反応後、ライセートと反応 Ａ，Ｂとも単体への非特異抗体の除去は行うと仮定すると、ライセート、担体および抗体の反応させる順番に何かキーがあるのでしょうか。 勝手な解釈としては、Ａ）は溶液中で抗体同志による架橋が効率よく起こる、Ｂ）は担体に結合した抗体でも同様に架橋が起こるが効率が悪くなると考えており、微量なターゲットを回収したい場合、Ａ）を選ぶべきではと考えております。 双方の反応系を試すつもりではおりますが、すでに経験を持っておられる方がおりましたらアドバイスを宜しくお願い致します。

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