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thank you very much! 削除/引用 No.1294-7 - 2008/06/10 (火) 19:03:41 - 293T TK-1 さん、Ｔさん、Neoさん、おおさん、Sh1さん 貴重なアドバイス有難うございました。 皆様が提供してくださった情報を元に、色々調べたところ、 1 Nero.以外の耐性遺伝子を持つ 2 SV40以外のpromoterを使用している 二つの条件満たすvectorを見つかりました。 pCMV-3TagというCMV promoter持つ、Hygromycine耐性のVectorを使うことにしました。 助言をしてくださった皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1294-6 - 2008/06/10 (火) 12:45:53 - Sh1 > よく使われる SV40 early promoter は SV40 replication origin を含んでいますよ。 ori とpromoterは別物ですが、Tさんが書かれた通り、SV40のpromoterを使用している市販のvectorのほとんどは、enhancer & promoter 領域にoriが入っています。 おおさん： > でなせstable lineを取るには不適だと思われるのかよく分かりません。 これについてはこちらを参照して下さい。 http://tools.invitrogen.com/content/sfs/productnotes/F_051025_MammalianExpressionVectors-TS-TL-MKT-HL.pdf

(無題) 削除/引用 No.1294-5 - 2008/06/10 (火) 02:04:06 - おお >[Re:1] 293Tさんは書きました : > 今、293T細胞を使って、目的遺伝子の過剰発現やknock-downのstable clone を作るという実験を計画しています。 > > 293TにSV40のlarge T抗原が導入されているので、SV40の複製起点を持ったプラスミドはガンガンに複製されるため、stable lineを取るには不適だと思います。 > > 調べた結果、ほとんどのVectorにはSV40promoterが入っていますが、...... > すでに指摘がありますが、oriとプロモーターは違います。ただpCIneoはori持っていたと思いますが、１度それぞれのベクターをご確認ください。 いっかせいにはこのoriとT-antigenで可也の発現が期待できますが、やはり薬剤で選択するとかかりますし、いっかせいの発現もある程度時間を置くと落ちてきて、最適なタイミングがありますのでいつまでもガンガンにコピー数を増やしているわけではないようです。 でセレクションするとどうなるかははっきりとは確認してないですが、エピソーマルで増えているものもあるかもしれませんし、ゲノムに組み込まれてしまうものあると思います。 でなせstable lineを取るには不適だと思われるのかよく分かりません。薬剤で維持されていて、発現していればいいわけですよね。 あるいは293Tの親株293を使えばいいのではないでしょうか。

耐性遺伝子に関して 削除/引用 No.1294-4 - 2008/06/10 (火) 01:23:51 - Neo 293T細胞は元々Neo耐性なので、Stable cell line を作るためのvectorにはNeo以外の耐性遺伝子（PuroやHyg等）を持ったものを選ぶ必要がありますよ。

(無題) 削除/引用 No.1294-3 - 2008/06/10 (火) 01:03:26 - T > SV40 promoterとSV40oriは違います。 よく使われる SV40 early promoter は SV40 replication origin を含んでいますよ。

(無題) 削除/引用 No.1294-2 - 2008/06/09 (月) 23:00:03 - TK-1 >[Re:1] 293Tさんは書きました : > 今、293T細胞を使って、目的遺伝子の過剰発現やknock-downのstable clone を作るという実験を計画しています。 > > 293TにSV40のlarge T抗原が導入されているので、SV40の複製起点を持ったプラスミドはガンガンに複製されるため、stable lineを取るには不適だと思います。 コピー数とステーブルを取ることとの間に相関があるとは思いませんが。 > 調べた結果、ほとんどのVectorにはSV40promoterが入っていますが、...... SV40 promoterとSV40oriは違います。ですので，SV40promoterが入っていることがどうだというのですか？ > 勉強不足で申し訳ございませんが、皆さん、私の実験目的に合うVectorの情報をご提供していただければ幸甚です。 取り立てて特別なものはいらないと思います。通常の発現ベクターを用いてセレクションをかけるか，あるいはlentiかretroで取るかだと思いますが。

発現vectorについて 削除/引用 No.1294-1 - 2008/06/09 (月) 20:41:16 - 293T 今、293T細胞を使って、目的遺伝子の過剰発現やknock-downのstable clone を作るという実験を計画しています。 293TにSV40のlarge T抗原が導入されているので、SV40の複製起点を持ったプラスミドはガンガンに複製されるため、stable lineを取るには不適だと思います。 調べた結果、ほとんどのVectorにはSV40promoterが入っていますが、...... 勉強不足で申し訳ございませんが、皆さん、私の実験目的に合うVectorの情報をご提供していただければ幸甚です。 よろしくお願いします。

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