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tubulinのウエスタンで真ん中が抜けてしまう!? トピック削除
No.1306-TOPIC - 2008/06/11 (水) 14:19:45 - ok
いつも勉強させていただいております。
ウエスタン初心者なのですが、inner controlとしてβtubulinを用いています。バンドはでるのですが、何度やっても中心が抜けて周りが縁取りされたような現像になってしまいます。
現像時間を長くすればしっかり、真っ黒になるのですが、現像時間を短くするとこうなってしまいます。

原因が分からずこまっております。どなたかご教示ください。
 
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No.1306-8 - 2008/06/12 (木) 23:45:34 - ok
ありがとうございました!それで行ってみたいと思います

(無題) 削除/引用
No.1306-7 - 2008/06/12 (木) 20:07:08 - mikan
ごめんなさい。抗体濃度を下げるのです!間違えました。

(無題) 削除/引用
No.1306-6 - 2008/06/12 (木) 17:58:25 - ok
なるほど とても勉強になりました。
二次抗体の濃度は下げるでいいんですよね?

(無題) 削除/引用
No.1306-5 - 2008/06/12 (木) 08:14:14 - mikan
B-actinを使うとき同じ状態になりますので、
おおさんと同じ解決法を取ります。
1次抗体濃度を下げる。2次抗体濃度を上げる、
発光基質をたっぷりかける。すぐに写真を撮るなどです。

どれか一つ変えるだけで違うと思います。
うまく行くとよいですね。

(無題) 削除/引用
No.1306-4 - 2008/06/12 (木) 02:11:18 - おお
チューブリンですから多分シグナルが強すぎて、コンタクトした時には気質が枯渇してしまっているのでしょうね。2次抗体の量を減らすのがいいかと思います。1次抗体の量も減らせる事がたいていです。

(無題) 削除/引用
No.1306-3 - 2008/06/11 (水) 15:43:58 - sea
すでに書かれた白抜けのほかに、こんなことも考えられます。

タンパク溶液をアプライした後で、1x sample bufferだけさらに
レーンに加えたりしていませんか?
こうすると先にアプライしたタンパクが脇に押しやらせてしまうため
同様の現象が見られます。
アプライするボリュームを各レーンでそろえようとして、あとから
補正しようとしていた後輩がそんなことを経験していました。

違うかもしれませんがご参考までに。

(無題) 削除/引用
No.1306-2 - 2008/06/11 (水) 14:25:18 - ~
ECLですよね?
(抗体に結合した)酵素量が多すぎると、基質がすぐに使い尽されるため、
中央部分の酵素量が多い部分では発光しなくなることがあります。

乗せるタンパク質量を減らすのは難しいでしょうから、
抗体量を減らしてみてはいかがでしょうか。

tubulinのウエスタンで真ん中が抜けてしまう!? 削除/引用
No.1306-1 - 2008/06/11 (水) 14:19:45 - ok
いつも勉強させていただいております。
ウエスタン初心者なのですが、inner controlとしてβtubulinを用いています。バンドはでるのですが、何度やっても中心が抜けて周りが縁取りされたような現像になってしまいます。
現像時間を長くすればしっかり、真っ黒になるのですが、現像時間を短くするとこうなってしまいます。

原因が分からずこまっております。どなたかご教示ください。

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