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(無題) 削除/引用 No.1310-5 - 2008/06/13 (金) 10:07:54 - RNAi 皆様ご意見ありがとうございます。 はじめにHela ２９３を用いて試薬などの検討をした結果Helaで良い条件が見つかったので、他の細胞でも同じ条件で検討していました。 細胞種が違うと条件も違うのかもしれません。 他の細胞でも条件をふって行いたいと思います。 個人的な印象としてはノックダウンはとにかくsiRNAを多く細胞に入れればいれるほど効くように思います。 またご指摘の通り、ノックダウンされた細胞とノックダウンされていない細胞を見ている可能性もあるので、蛍光オリゴと同時にトランスフェクションして、導入効率の良い細胞を見分けて実験してみようと思います。 shRNAの安定発現株は試したのですが、完全なノックダウンはできませんでした。アデノは導入効率が良さそうなので、行ってみたいのですが、ここのラバではアデノを使っている人がいないので、立ち上げに時間がかかりそうで躊躇してしまっています。機会があればやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1310-4 - 2008/06/12 (木) 22:47:08 - MK RNAiの効率が悪いとありますが、なぜ効率が悪いのかを検討してみてはどうでしょうか？ 先のお二人もおっしゃっているように他の細胞株ではsiRNAのトランスフェクションの効率が悪いため、ノックダウンされていない細胞に含まれるタンパク質がウエスタンで検出されてしまっているように思われます。 もしトランスフェクション効率がHeLaと変わらないのであれば、元々の発現量が多いとか細胞内でのタンパク質の分解速度が異なっていたりすることが考えられます。そのときは導入するsiRNAの量を増やしたり、導入後に解析を行う時間を変更してみたりする必要があると思います。 一度ノックダウン効率が悪い細胞を免疫染色してみてはどうでしょうか？細胞ごとに観察すればノックダウンされている細胞とされていない細胞が区別でき、解析出来るかもしれません。 私のところでもリポフェクタミンRNAiMAXを使用しています。HEK293,HeLaをはじめとする培養細胞で問題なくノックダウン出来ています。 もし細胞群すべてでノックダウンする必要があるのであればvectorベースのshRNAiで一度薬剤選抜したり、アデノウイルス等による感染等で導入するという方法も考えられると思います。

(無題) 削除/引用 No.1310-3 - 2008/06/12 (木) 02:42:51 - おお 293は入りやすい部類だと思います。リポフェクタミン2000を使うことが私はおおいです。1/3と言う事ですが、実際よくノックダウンされた細胞とそうでない細胞が混在すると思いますので、個々細胞の観察であれば、効率的にノックダウンされた細胞で見れば良いのではと思ったりもします。たとえば隣接するあまりノックダウンされてない細胞と同時に写真に収めると、ノックダウンと形質の関係がアピールできると思いますが、、、、

(無題) 削除/引用 No.1310-2 - 2008/06/11 (水) 17:21:28 - りょう 3分の１はちょっと効率悪いですね。 でも入った細胞ではほぼ完全に抑制されていて、入ってない細胞が混ざっているからwesternでは3分の１に見えるのでしょう。 293, HepG2あたりは蛋白で5分の１から10分の１レベルまでノックダウンできるはずです。 異なる細胞に移行するより、トランスフェクション方法を検討された方が良いのではないでしょうか？ 293なんかは最も入りやすい部類でしょうし、ポピュラーなリポフェクションで抑制可能でしょう。 HepG2はエレクトロポレーションだと効率かなり良いです。

RNAi効率のよい細胞 削除/引用 No.1310-1 - 2008/06/11 (水) 16:14:02 - RNAi 過去のトピックを探したのですが、同じようなものが見つからなかったので質問させていただきます。 もし同じトピックがあればそちらを教えていただけると幸いです。 現在、細胞内輸送系の実験を行っています。 siRNAのトランスフェクションによる目的遺伝子のノックダウンによってフェノタイプを観察しているのですが、かなり微量でも機能をしているたんぱく質のためか、フェノタイプが弱くて困っています。 まずトランスフェクションの条件検討をした結果、HelaとリポフェクタミンRNAiMAXが我々の研究室では一番効率よくノックダウンできました。 ウエスタンレベルですと、検出できないレベルまで減少します。 もちろん抗体による検出なので、ゼロまで減っているとはいえませんが、感度の良い抗体を用いて、バンドの濃さで見る限り1/10以下になっていると言えるぐらいです。 実際にウエスタンで細胞内輸送系のdefectもしっかりと見えました。 ですが不運なことに私の行っている細胞内輸送系の免疫染色による観察はHela細胞では非常に観察しにくい構造体のため、他の細胞で行う必要がでてきました。 そこで他の細胞のノックダウンを検討しました。 293, HepG2, NIH3T3, MEFなどを試みました。 どれも目的遺伝子のノックダウンは1/3以下にはなってはいるのですが、フェノタイプが微妙になってしまいます。 これらの細胞以外にRNAi効率の良い細胞をご存知ないでしょうか？

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