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(無題) 削除/引用 No.1314-5 - 2008/06/12 (木) 15:53:56 - ゲノミックDNA おおさん、コメントありがとうございます。 おおさんの言う通り、今回、組織サンプルの数が多かったこともあって、いつもはハサミで細かくするところがかなり大雑把になっていたと思います。さらに組織のボリュームが大きかったものほどゼリー状になっていることから推測すると、proKが行き届なかったために起こってしまったように思います。そういう意味では仰る通り、ゼリー状のものの一部をもう一度SDS-proK処理して再抽出するとよいように思いました。 濃いDNAを沈殿させるためにエタ沈の塩やアルコールの追加をすること、また精製度をあげるために6Mの尿素を加えることもやってみる価値は十分あると思いました。 いろいろなアドバイスどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1314-4 - 2008/06/12 (木) 15:14:47 - おお 私は幾らか原因があって、複合的ではないかとも思います。で汚いとそういう傾向にあります。SDS-proKで処理する時、細胞がうまく分散されてないと、ゲル状といいますか不均一でねんちょう性の高い部分ができてしまったりします。これは特に細胞の場合ですが、組織でも起こりうるのではないかと思います。ただ組織片をそのまま処理しても大丈夫な場合はあります。もし組織をメスなどで刻んだりしてない状態で処理しているならそういてみてもいいかもしれません。あとDNAが余りにも濃いとそうなりがちです。こういう場合はそういう場所にProKが行き届かなかったたりして悪循環になりますので、なるべくスケールアップ(そしきに対するSDS-ProKの量をふやす)を心がけるようにしてます。沈殿でゼリー状になるのはそれでも回収できれば何とかなるかもしれませんが、やはりDNA量がおおいと塩濃度が不足して完全に沈殿しないことがあるようにも思います。塩とアルコールを少し追加すると沈殿しやすいと思います。 ゼリー状のものをどうリカバーしたらいいかは、原因によるのでなんとも言いがたいですが私は不純物が多そうな場合は、もう一度SDSProKをくわえて処理しながら溶かし再精製したりしとことはあります。それでうまく行くこともあります。ここでどなたかきれいなゲノムDNAを取る時はエタチンを始める前に溶液の尿素の量が6Mぐらいになるように加えてからエタチンすればいいと教えてもらったことがあります。 ゲノムは試してませんが、プラスミドなどもこの方法で可也キレイになっているようにおもえます。 上記のようなトラブルの時のリカバーの際も尿素を使うといいかもしれません。 サンプルから糖などの除去では植物で使われるような方法もいいかもしれません。組織から核を取ってこれるなら、それでもうまく行くかもしれないと思います。 あとはゲノムですから代わりに違う組織は使えないでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.1314-3 - 2008/06/12 (木) 13:04:51 - ゲノミックDNA APさん、コメントありがとうございます。 多糖類でゼリー状になるのですね。proK処理後の４度保存は今度からやめるようにします。肝心な残りのサンプルですが、PCI前のフェノール処理をローテートだけにしていましたが、多糖類を除くためにゲノムが切れない程度に先切れチップでピペッティングしてよく混ぜてみようと思います。その程度じゃダメかもしれませんが。。。 CTAB法というのは初めて聞きました。植物では細胞壁があって、その多糖類を除くために普通に行われているようですね。上の方法でダメならトライしようと思います。 目的はサザンブロッティングなのですが、一応ゼリー状だったものを制限酵素処理してみるとゼリー状ではなくなり、泳動するとスメアが認められたので後はトランスファーさえうまくいけば何とかなるのではと思っています。

(無題) 削除/引用 No.1314-2 - 2008/06/12 (木) 12:25:17 - AP ゼリー状になるのは多糖類でしょうかね。 RNAの抽出のときにしばしば経験します。ゲノムDNA抽出でも植物を扱っている人にはありがちなことではないでしょうか。 動物だとゲノムDNA精製の時にそうなることはあまりないように思いますが、 加熱（ProK処理の）のあと低温で保存したのが固まってしまった原因かもしれません（ムコ多糖などはそうなる可能性がありそう）。 やり直すなら、途中で冷蔵保存しない、多糖類を効果的に除く手法を採用する（PCIの前にPhenolで抽出する、植物でよく使われるCTAB法でやる、とか）と良いかもしれません。 いったん凝固してしまったところからDNAを精製するには、どうしたらいいでしょうねえ。ゼリーをホモジナイズしてCTAB法で抽出するとか、、、

マウスの臓器からゲノムDNA抽出 削除/引用 No.1314-1 - 2008/06/11 (水) 22:30:46 - ゲノミックDNA マウスの臓器からゲノムDNAを抽出しようとしています。SDSの入ったLysis bufferにかなり大きめに臓器を入れて（例えば腎臓片方まるごと）ホモジナイズ後、ProK処理（150ug/ml）を一晩行いました。しばらく４度で保存していたものを先日フェノール抽出、フェノクロ抽出、クロロホルム抽出とやっていったのですが、先切れチップで水層を取ろうとすると水層から中間層にかけて大きなゼリー状になって塊で取れてきました。イソプロ沈、70%エタノールでリンス後もペレットにならず、大きなゼリー状の塊のままで濃度を測定しようにも少量とることができません。同時に培養細胞から行ったものはペレットになって精製度もよかったので、抽出方法自体は悪くないと思っているのですが、これはどのようなものが取れてきたのでしょうか？また残りのサンプルからゲノムDNAを何とか抽出したいと思っているのですが、よい対処方法があれば教えてください。宜しくお願いします。

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