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HE染色について トピック削除
No.1320-TOPIC - 2008/06/12 (木) 19:08:15 - のび太
現在、我々のラボでは免疫染色しかしたことがないです。
これから、HE染色をしようと考えているのですが、免疫染色の手法をどう応用したらいいか分かりませんので、是非ご教授いただきたいです。
現在の免疫染色のプロトコルは、
@PBSにて脱血し、４％PEAで灌流し、目的組織を摘出し、４％PFAに４時間漬ける。
A30％スクロースにて24時間４℃でインキュベート。
Bパラフィンで包埋し、30μmに薄切。
CPBSにて10分gently shake。
Dブロッキング
E１次抗体
・・・・としています。

是非、このプロトコルを応用したHE用プロトコルを教えて下さい。
お願いします。
　
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.1320-12 - 2008/06/13 (金) 18:31:39 - のび太
…

(無題) 削除/引用
No.1320-11 - 2008/06/12 (木) 21:04:01 - のび太
退色防止剤が入っていますので、辞めておきます。
いろいろとありがとうございました。
助かりました。

(無題) 削除/引用
No.1320-10 - 2008/06/12 (木) 20:54:14 - 組織
ベクタシールドとは、蛍光染色用封入剤のことですか？
退色防止剤とかDAPIが入っているなら、使わない方が無難でしょうね。
できないことはないでしょうが、変な色が入ったり変色したりするような気がします。
それらが入ってなければ使えると思いますが、HE染色の封入なら普通のグリセロールで十分です。

水溶性封入の場合、プロトコールを
Fエオジン染色
G純水で3回洗浄
H水溶性封入剤で封入
に変更してください。

(無題) 削除/引用
No.1320-9 - 2008/06/12 (木) 20:42:07 - のび太
たびたび申し訳ないのですが、封入にはベクタシールドは使えるのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1320-8 - 2008/06/12 (木) 20:38:41 - のび太
いえ。
新しくサンプルは作るのですが、パラフィンはウチでは採用していませんので、コンパウンドに包埋して、薄切は５μmで行ってしようと思っているのですが、その後の操作がどうすればいいのか。
PBSで洗浄して、すぐにヘマトキシリン液に漬ければいいのですかね？

(無題) 削除/引用
No.1320-7 - 2008/06/12 (木) 20:38:25 - 組織
更新忘れてました。
やっぱり誤解してましたね、すみません。

プロトコールですが、@Aの続きから
B5-10 umに薄切。
C純水に5分浸漬
Dヘマトキシリン染色
E流水洗5分→純水に1分浸漬
Fエオジン染色
Gエタノールシリーズで脱水→キシレン5分3回
H非水溶性封入剤で封入

染色液はパラフィン切片と同じもので大丈夫です。
染色液の状態に応じて、染色時間を調整してください。

(無題) 削除/引用
No.1320-6 - 2008/06/12 (木) 20:28:25 - 組織
質問を重ねて申し訳ありませんが、質問者さんの目的は「今持っている凍結組織サンプルを使ってHE染色をする」ことでしょうか？

初めは「新たにパラフィン包埋組織を作ってHE染色をする」かと思ってましたが、、、どうも違いそうなので。

(無題) 削除/引用
No.1320-5 - 2008/06/12 (木) 20:25:25 - のび太
パラフィンでのプロトコルは入手できたのですが、それをコンパウンドに応用するやり方が知りたいのです。
脱パラフィンの作業なのか、HE染色の作業なのかが明確に判断できませんでしたので。

(無題) 削除/引用
No.1320-4 - 2008/06/12 (木) 20:23:07 - のび太
あ、間違いでした。
コンパウンドです。
すみません。

(無題) 削除/引用
No.1320-3 - 2008/06/12 (木) 20:15:52 - 組織
> @PBSにて脱血し、４％PEAで灌流し、目的組織を摘出し、４％PFAに４時間漬ける。
> A30％スクロースにて24時間４℃でインキュベート。
> Bパラフィンで包埋し、30μmに薄切。

気になったのですが、このプロトコールは本当ですか？
B凍結用コンパウンドで包埋し、30μmに薄切
の間違いではないですか？

(無題) 削除/引用
No.1320-2 - 2008/06/12 (木) 20:10:30 - 組織
一度成書を読まれた方がいいと思います。
ホルマリン固定パラフィン包埋切片のHE染色は基本的な手法ですが、意外とステップが多く、要所を理解しておく必要があります。
古典的な手法ですので、いろんな本に載ってるはずです。
あるいは、形態学専門のラボに教えてもらうのも手だと思います。

ちなみに、もし質問者さんのラボがパラフィン包埋組織を扱ったことが無ければ、以下の機器が必要になると思います。
薄切にはクリオスタットではなく、ミクロトームを用いる。
パラフィンを60℃程度に加温するための恒温器（パラフィン融解器）が必要。融けたパラフィンは結構揮発するので、専用で使った方がよい。

HE染色について 削除/引用
No.1320-1 - 2008/06/12 (木) 19:08:15 - のび太
現在、我々のラボでは免疫染色しかしたことがないです。
これから、HE染色をしようと考えているのですが、免疫染色の手法をどう応用したらいいか分かりませんので、是非ご教授いただきたいです。
現在の免疫染色のプロトコルは、
@PBSにて脱血し、４％PEAで灌流し、目的組織を摘出し、４％PFAに４時間漬ける。
A30％スクロースにて24時間４℃でインキュベート。
Bパラフィンで包埋し、30μmに薄切。
CPBSにて10分gently shake。
Dブロッキング
E１次抗体
・・・・としています。

是非、このプロトコルを応用したHE用プロトコルを教えて下さい。
お願いします。
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