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(無題) 削除/引用 No.1321-4 - 2008/06/13 (金) 11:38:43 - Pumpkin 私は、APさんのご紹介にもあるように、total RNAからclontechのSMARTキットを用いて完全長cDNAを合成してやっています。totalから出来るところが魅力ですし、total RNA 50ngから出発できることになっています（私は量に制限がなかったので1ugから始めましたが）。コントロールもついています。私個人としては非常に良いキットであると思います。 ただ、ご指摘があるように、難点は高いです。libraryのconstraction kitの方は分かりませんが、cDNA合成キットは7回分で20万位です（実質は1st鎖から2nd鎖合成&PCRを何回分かできるのでcDNA library作製には問題にならない回数です、いろいろなライブラリーを一気に作るには7ライブラリーしかできません）。アカデミアならもう少し安いです。ライセンス同意も要ります。

(無題) 削除/引用 No.1321-3 - 2008/06/13 (金) 11:11:28 - う〜んと 作製したライブラリーを何に使いたいかによっても話が違ってくると思いますが。 ずいぶん昔ですが、APさんの紹介されたキットを使って、測定できないくらい微量（最初から諦めて定量してません）のトータルRNAからcDNAライブラリを作ったことがあります。 サイズ分画もしたりしてモディファイしましたが、8割くらいはrRNAのクローンだったと記憶してます。 なので5μGもあればやれないことはないですが、作ったライブラリーからフルレングスcDNAクローンを取りたいとかっていうのは難しいかもしれませんし、スクリーニングに10倍くらいの量を覚悟する必要があるかもしれません。 ＃ポリAをとって損失するよりは10倍スクリーンするほうがいいようにも思えますが。

(無題) 削除/引用 No.1321-2 - 2008/06/13 (金) 09:43:06 - AP 従来の方法ではtotal RNAでcDNA libraryを作ることは可能だけれども、oligo-dT primerでも、rRNAから逆転写されたcDNAが大量にできて非常に品質が悪くなるといわれていて、poly A精製は必須でした。rRNAにoligo-dT primerがぴったりアニールする配列はないかもしれませんが、mono nucleaotide streachが多いですし、なにしろrRNAはコピー数が大量にありますので。 また、従来の方法ではpoly A RNAで1 ugは必要ですから、total RNAが5 ugではやはり難しいのではないかと思います。ヘタにpoly Aを精製しようとするとロスでますます厳しくなるかもしれないですし。 わたしはclassicな方法しか経験がありませんが、最近では微量のRNA、total RNAからでもcDNA libraryが作製できるというキットも製品化されているようです。例えば http://clontech.takara-bio.co.jp/product/catalog/2003067A.shtml 結構、高い

cDNAライブラリーの作製について 削除/引用 No.1321-1 - 2008/06/12 (木) 20:28:22 - gin お世話になっています。 cDNAライブラリーを作製することになってのですが、希少な細胞のためRNAが 5マイクロgしかありません（しかもtotal RNAです）。プロトコールを 調べるとmRNAで数マイクロg必要のようです。きれいなライブラリーを 作製するには、かなり量はなくなってしまいますが、tolal RNAから数％の mRNAを精製してからのほうがやはり良いのでしょうか。total RNAから作製した経験のあるかたはいらっしゃるでしょうか？

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