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(無題) 削除/引用 No.1323-14 - 2008/06/13 (金) 18:07:44 - sea 私はwindowさんの意見に全面的に賛成です。 >傷害性の本態がおそらく補体だろうという根拠は、以前試しに非働化（56℃ >30分）してみたら傷害性がなくなったためです。 私はこれは根拠として弱いと思います。 血清にはgrowth factorやサイトカインなども含まれており、 もともとの環境にそういうものが追加されることで 細胞のviabilityに問題が出る可能性は十分ありえると思います。 すでに提案されていますが、私なら (1) 患者血清のfractionをとり、目的因子が含まれるfractionに 障害性がないことを祈る (2) 目的因子の精製をする (3) 非働化していないヒト血清で死なない細胞を探す (通常からヒト血清で培養することになっているヒト由来細胞とかが あればいいかも。でもお金がかかりそうです) マウス細胞にヒト血清を振りかけてするアッセイ、というのが そもそもデザイン的に難しいのかもしれませんが、 同じような系をデザインしているアッセイがあれば参考に なるかもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.1323-13 - 2008/06/13 (金) 17:57:46 - ゆるびっしゅ・だう おっと、気付いたらこんなにコメントをいただいておりました。 皆様ありがとうございます。 window さん FCSなどは非働化しなくてもよいようですね。 胎児の血清には補体が十分含まれていないからだと聞いたことがあります。 いずれにせよ、今回の実験系ではヒト（成人）血清を用いるので、ロットをえり好みするわけにもいかないかと思いますが。。 L さん 血清中の何かのタンパク質の定量ぐらいならEDTAでも問題ないかもしれませんが、お察しの通り（そしてうーんとさんのおっしゃる通り）、今回はバイオアッセイを行ないますので、細胞への“人食い”的作用は確かに怖いところですね。 そして、都合の悪いことにバイオアッセイで用いている反応は（おそらく）細胞外カルシウム依存的なのです。 ~ さん 阻害剤（Rosmarinic acid）は先程注文しました。 納期がいつになるかはまだ分かりませんが、まずはこれを試してみたいと思っています。 もちろん、この阻害剤自体がアッセイに用いる反応に影響を与えないことは確認いたします。 フラボノイドのようですので、何かその他の作用があってもおかしくないでしょうね。うまくいくとよいのですが。 ただ、樹立した細胞株から、ヒトの血清に自然に耐性を獲得したものをスクリーニングしてくる、というアイデアは私も考えていたところです。 ヒト血清を大量に使うことになりそうなので実行に移すことを少しためらっていたのですが。 もしくはDAFのような補体制御タンパク質を共発現させる、とかも可能性ありますかね。 いろいろトライしてみます。

(無題) 削除/引用 No.1323-12 - 2008/06/13 (金) 17:19:11 - L あ、そうですね。 EDTAはダメですね。 まさに、人食い的（非特異的）すぎますね。

(無題) 削除/引用 No.1323-11 - 2008/06/13 (金) 16:57:33 - ~ 阻害剤でうまくいけばいいですけど、 その阻害剤で目的のタンパク質の作用が影響を受けないかどうかがちょっと不安です。 バイオアッセイであれば、改変した細胞は今あるものでなくてもいいですよね？ 阻害剤を試しながら、手持ちの細胞に一通りヒト血清をかけて死なない細胞をスクリーニングして、 その中からバイオアッセイに使えるものを作成されてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1323-10 - 2008/06/13 (金) 15:15:29 - うーんと EDTAは止めた方がいいでしょう。 ちゃんとした阻害剤を使うべきです。 EDTAでたとえ補体が阻害されたとしてもそれ以外のあらゆる反応も阻害されますので、人食い的（非特異的）すぎます。

(無題) 削除/引用 No.1323-9 - 2008/06/13 (金) 14:38:56 - L 補体の非働化は熱処理が一般的ですが、 EDTAで簡単に不活化できます。 EDTAが使える実験系なら、お勧めです。 濃度は10 mMぐらいですかね

(無題) 削除/引用 No.1323-8 - 2008/06/13 (金) 14:00:13 - window 私が前いたラボでは基本的に血清の非働化を行わずに細胞培養を行っていました。 初めは驚いたのですが、そのラボでは古くからそうしているようです。 実際に細胞はちゃんと生きています。 その頃聞いた話だと、非働化はＥＳ細胞などの細胞には必須ですが、大体の不死化細胞には必要ないとのことでした。 現在のラボではもちろん非働化を行った血清を使用していますが、個人的には非働化はそれほど細胞培養に関係ないように思っています。 だうさんのお話を読んだ限りでは、単に血清が合っていないような。 結局のところ ある因子を精製して、それを培地に加える実験をしないといけないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1323-7 - 2008/06/13 (金) 13:24:48 - ゆるびっしゅ・だう ~ さん ヒトの血清で培養を行なうわけではないのです。 マウスの細胞を、ヒトの血清中のある因子に応答するように改変したので、そこにヒトの血清をふりかけてバイオアッセイをしようという実験です。 傷害性の本態がおそらく補体だろうという根拠は、以前試しに非働化（56℃30分）してみたら傷害性がなくなったためです。 ただし、この場合目的の因子も失活してしまうようで、アッセイそのものが困難になってしまったため、残念ながら熱処理はできないのです。 なお、健常人と患者の血清はもちろん比較していますが、どちらでも傷害性はでます。 それはさん Rosmarinic acidですね。 ありがとうございました。とても参考になりました。 早速購入してみたいと思います。 いずれ機会がありましたらこちらで結果を報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.1323-6 - 2008/06/13 (金) 12:30:01 - それは こんにちは。 補体系阻害剤をお教えいたします。 BIOMOL社から出ているRosmarinic acid です。 Cat no. 20283-92-5です。 C5転換酵素の阻害剤ですよ^^

(無題) 削除/引用 No.1323-5 - 2008/06/13 (金) 12:25:04 - ~ 今やられている系で、目的の細胞を培養できる根拠は何ですか？ まだ系が立ち上がっていないのにいきなり本番をやっているように読めるのですが… 病気に関する実験であれば、患者さんの血清とならべて、 健常者の血清をコントロールにして調べていると思いますが、 そちらはどういう結果なのですか？ または、サンプルだけでしか実験していないのですか？

(無題) 削除/引用 No.1323-4 - 2008/06/13 (金) 10:03:29 - ゆるびっしゅ・だう コメントありがとうございます。 質問時に書いておくべきでしたが、血清はヒト（ある病気の患者）の血清を使っています。 細胞はマウスです。 ですので、seaさんのご指摘の通りこの細胞毒性が本当に補体によるものなのかは不明なのですが、残念ながら血清を他のロットに変える、という選択はできない状況です。 それはさんのご指摘にもありましたが、「補体の阻害剤」というのがあるのですか？ 不勉強にして知りませんでした。 私が知っていたのは唯一「eculizumab」のような中和抗体でした。 よろしかったら、どのような阻害剤かお教えいただけますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1323-3 - 2008/06/13 (金) 03:05:03 - sea 細胞と血清の種類にもよるのだと思いますが、 書かれた内容からはいくつか疑問がわいてきます。 (A) これは本当に非働化をしていないことが原因で 細胞が死んでいるんでしょうか？ (B) 非働化が細胞のviabilityに差を作るとして、それが 本当に補体と関連しているのでしょうか？ 非働化の論理的根拠は教科書的にもあまりはっきりしない ようなことが書いてあるので、非働化の有無が本当に 補体の不活化だけを行っていてほかのタンパクに影響がないのか どうか不明ですよね。 仮定されたようにあ非働化の有無で補体が不活化され、 細胞死のrateが変わる場合、 (1) 血清をかえる(ロット、種類) (2) 無血清培養にする (3) 今の血清の補体を阻害する などの方法が考えられるわけですが、 上記の疑問があることと、この血清を使い続けないと いけない状況がよくわからないので とりあえずこれ以上のコメントは現時点では避けます。

(無題) 削除/引用 No.1323-2 - 2008/06/12 (木) 23:23:47 - それは 阻害剤でいいんじゃないでしょうか。

補体の不活化 削除/引用 No.1323-1 - 2008/06/12 (木) 23:10:57 - ゆるびっしゅ・だう わけあって非働化できない種類の血清を使っているのですが、すると細胞がかなりの割合で死んでしまいます（当然といえば当然ですが）。 セオリー通りに考えると、おそらくは血清中の補体が異種動物由来の培養細胞を攻撃しているのだと思います。 こういった場合、補体を効果的に不活化する方法はあるのでしょうか？ 抗体で中和するぐらいしか思いつかないのですが、それだとコスト的にちょっときついですよね。。

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