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(無題) 削除/引用 No.1328-12 - 2008/06/16 (月) 14:33:58 - 小児科医師（ゆとり教育） みなさま、ご回答ありがとうございました。 回答を参考にさせていただき、今夜、染色してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1328-11 - 2008/06/13 (金) 18:16:47 - 組織 Hoechst 33258は生細胞に染まらないんですね。33258も33342も両方染まると思ってました。 Hoechstだけで染めたいとのことなどで、核の形態観察が目的かと思い込んでました、、

(無題) 削除/引用 No.1328-10 - 2008/06/13 (金) 17:39:38 - sea 33258だと固定しないと入らなくて、live cellだと 全体数の中で核の形態が変化しているものをカウントするのに 苦労します。 というわけで私の周りでは33342を使っている場合が多いのですが、 さらに、live cell で33342とPIの二重染色で二つの波長で 写真を撮って説得力を増すことも一応可能です。 あくまでカウントはHoechstで、PIはアポトーシス細胞が どのような染色像をそれぞれで示しているかを見せるため、 みたいな感じです。 ほかに二つの波長で写真を撮りまくって、あとで PIとHoechstを照らし合わせながらアポトーシス細胞の数を カウントする、と言うことも一応可能です。 まあでも結局apoptosisの評価は一つの方法だけでは 不十分で、複数の方法で評価をする、というのがconsensusな ような気がするので、別の方法もあわせて考えてみることを お薦めします。

UPされなかったので2つに分けました 削除/引用 No.1328-9 - 2008/06/13 (金) 17:19:03 - おお 活性型カスペース3で染色というのもありますね。H33342/33258を使うのはフローサイトでもあまり信用ができない、細胞によってはうまく行かないと言うのが下のリンクで議論されているようです。 www.cyto.purdue.edu/hmarchiv/1997/2084.htm その他WEBでひろったものを はっつけておきます。 www.merck.co.jp/japan/chemical/pdf/bioinsight/no39.pdf www.dojindo.co.jp/letterj/084/84topics1.html

? 削除/引用 No.1328-8 - 2008/06/13 (金) 17:16:37 - おお 手技的にはただの染色,とおもったのですが、生細胞で33258が取り込まないのを利用して、細胞死を検出しようというのはあるようです。培養しているコンディションで濃度は1ug/mLぐらいをよく使っているようですが、、、不思議なことにH33342も同じ様に使われているようです。この手の方法でしたらPI(Propidium iodide)の法が一般的のように思えます。PIはフェノールレッドが邪魔をするので色素フリーのバイチを使った方がいいと思います。 固定してしまうと、すべての細胞が染まりますので特異的に染めるというよりは、核の形態からアポトーシスが起こった細胞かどうかを判断することになると思います。ただ核の形態が変わるというのはアポトーシス後期という事でアポトーシスが起こっている細胞の数を必ずしも見てはいません。培養じのPI取り込みやアネキシンV染色は固定せずに染色することで死んだ細胞を見つけることができ、早期の細胞死を検出できますが、アネキシンVはフローサイトいがいで使っているかよく分かりません。H33342はバイチ中に1ug/mlぐらいを加え30minぐらい培養するとすべての細胞が染まります。固定せずに核の形態を見ることができます。

(無題) 削除/引用 No.1328-7 - 2008/06/13 (金) 15:55:50 - 組織 おおさんがいわれているように、手技的にはただの染色ですね。 固定細胞なら、 固定 PBS洗浄 1 ug/ml Hoechst in PBSで、室温遮光下で15-30分反応 PBS洗浄 水溶性封入剤で封入（省略可） 蛍光顕微鏡観察 私は単に免疫染色の対比染色で使いましたが、核の形態や核質の濃淡を十分区別できました。 より詳細な形態を見られるのであれば、染色液を薄くするか反応時間を短めにして、バックをできるだけ抑えた方が評価しやすいかもしれません。 あと、固定はホルマリン（あるいはPFA）でもグルタールアルデヒドでもあまり変わらないと思いますが、一般的にグルタールの方が形態保持能に優れています。 生細胞でも、固定操作を抜いて同じやり方でできると思いますが、生細胞を扱ったことがないのでわかりません。 Hoechstを取り込ませる分、反応時間を長めにした方がいいかなとは思いますが。。

(無題) 削除/引用 No.1328-6 - 2008/06/13 (金) 12:55:09 - 小児科医師（ゆとり教育） みさん、おおさんご回答ありがとうございます。 チェンバースライドで培養し、シクロスポリンを加えてアポトーシスを誘導 して観察します。生きている状態でも、固定した状態でも構いません。

(無題) 削除/引用 No.1328-5 - 2008/06/13 (金) 12:14:24 - おお 基本的に核の形態を見るわけですから、一般の染色と変わらないと思います。どのような状態で観察する予定でしょうか。

再訂正 削除/引用 No.1328-4 - 2008/06/13 (金) 11:57:28 - み 監修者名は田辺（×）ではなく田沼（○）です． 度々申し訳ありません．気をつけます．

訂正 削除/引用 No.1328-3 - 2008/06/13 (金) 11:55:03 - み テキストは羊土社ではなく秀潤社でした． 改訂アポトーシス実験プロトコール1基礎編　田辺靖一監修 早とちりしました．訂正いたします．

羊土社のテキスト 削除/引用 No.1328-2 - 2008/06/13 (金) 11:42:26 - み 羊土社のテキストでは， 1%グルタルアルデヒドin PBS(-)で固定 ↓ 洗浄 ↓ 細胞をPBSに浮遊 ↓ 1mMのヘキスト33258を4ul添加 ↓ スライドグラスに1滴のせ検鏡 とありました． 培養細胞を使ってこの方法でやりました．きちんと核は染まりました． 組織切片での方法は申し訳ありませんが分かりません． ご参考になれば幸いです．

Hoechst　33258によるアポトーシスの観察 削除/引用 No.1328-1 - 2008/06/13 (金) 10:07:04 - 小児科医師（ゆとり教育） いつもお世話になっております。非常に基本的な質問で申し訳ないです。 Hoechst　33258を使って腎尿細管細胞のアポトーシスを蛍光顕微鏡で観察 したいと思っています。SigmaのHoechst　Stain　Solutionが研究室に残って いたので、それを使おうと考えているのですが、マニュアルがありません。 SigmaのHPをみても、具体的なマニュアルがありませんでした。 Nature　Protocolなど検索してみましたが、フローサイトメトリーで 観察する方法や、三重染色する方法などのプロトコールはありましたが 単純にHoechst　33258だけで染めて蛍光顕微鏡で見るというマニュアルが ありませんでした。おそらく、三重染色のプロトコールを流用すれば いいとは思うのですが、できればHoechst　33258だけのマニュアルを入手 したいと思っています。 どなたか、よいプロトコールをお持ちではないでしょうか。

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