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(無題) 削除/引用 No.1329-5 - 2008/06/15 (日) 22:17:08 - 大腸菌 核膜... ＞核膜が破砕されるせいか、 ＞ソニケータでも核膜は壊れますが

(無題) 削除/引用 No.1329-4 - 2008/06/13 (金) 16:50:20 - dic いただいたアドバイスに従い、リゾチウムを加えて３０分ほど処理した後、 そのBufferのままソニケーションにかけると、かなりきれいに壊れていました。 DNaseも、と思っていましたが、今回は容量に注意したせいか、ほとんど粘性のないサラッとした液体になっていました。 素早い回答、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1329-3 - 2008/06/13 (金) 13:37:37 - リフォールディング運なし (1)十分破砕されているかどうか見ていないので分かりませんが、 文面からすると破砕されてない気がします。 (2)「きーん」だと思います。 ホーンの先から超音波が出るので、あまり底に近づきすぎるのは 効率が悪いのではと思ってます。 だからといって液面すれすれだと泡が発生しやすいです。 そんなわけで、液面から半分〜半分よりちょっと上になるような感じで ホーンを差し込んでいます。 また、サンプル量が多すぎるとかいうことはありませんか。 私もこないだ初めて取扱説明書を見て、使っているホーンがサンプル量に 合っていないということを知りました。取扱説明書、重要。 (3)APさんの言われているとおり、破砕時にDNaseをついでに入れて さらさらな溶液にして遠心して回収します。 DNaseを入れなくても、めいっぱい超音波破砕すると結構サラサラになるかと思います。 酵素などが可溶化した状態で欲しい時は超音波かけすぎは良くないのでしょうが、 封入体ならあんまり気にしないでも良いような気がします。 私も自己流だという自覚があるので、あくまで参考で…。

(無題) 削除/引用 No.1329-2 - 2008/06/13 (金) 13:15:22 - AP ソニケータをうまく使いこなそうということにこだわらなければ、 界面活性剤（Trion-X100やNP40）で溶菌しても良いのではないでしょうか。 界面活性剤で溶菌するときはlysozymeも加えて細胞壁を壊してやります。 ゲノムDNAによってずるずるに粘性がでますので、DNaseを加えて分解します（RT-PCR用など高純度のものはもったいないですから、グラムいくらで売っているような粗精製のDNaseの粉末で十分です）。細かいプロトコールは成書をご覧ください。 ＞核膜が破砕されるせいか、溶液がドロドロの状態になって、うまく洗浄できません。 ソニケータでも核膜は壊れますが超音波でDNAが剪断されるので粘性が出にくいです。なので、今回のような場合は、界面活性剤とソニケータの合わせ技で、溶菌とDNAの剪断ををしても良いと思います。

ソニケーターの正しい使い方 削除/引用 No.1329-1 - 2008/06/13 (金) 12:28:16 - dic 大腸菌に融合タンパク質を発現させ、封入体よりのタンパク質精製を試みています。 菌体破砕の最初のステップで、ソニケーターによる破砕を行っているのですが、壊れ方が悪い気がします。 プロトコルいわれている条件で破砕すると、 確かに、破砕前よりは菌体ケンダク液は透明に近づいているようにみえるのですが、それを検鏡してみると、 動いている大腸菌が多数見え、破砕前とあまり変わらないように見えるのです。 また、それをそのまま、４％Triton X-100による洗浄に持っていくと、 核膜が破砕されるせいか、溶液がドロドロの状態になって、うまく洗浄できません。 そこで、お聞きしたいことなのですが、 １）その状態で、「十分壊れている」としていいのでしょうか？ ２）破砕をかけているとき、ソニケーターの棒の突っ込み具合をかえると、 発する音が、「キーン」とした音になったり、「ジジジジジ・・・」という音がしたり、まちまちなのですが、どの状態が効いている状態なのでしょうか？ ３）封入体の洗浄は、上記のようなドロドロを無理に吸い取っていくものなのでしょうか？ ご存知の方、お教えください。

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