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(無題) 削除/引用 No.1331-28 - 2008/06/17 (火) 19:24:58 - 通りすがり2 cold shockは別として、on iceの状態でも、リン酸化は割と起こります。細胞膜を取ってきて、P32-ATPとincubateしたら、よくわかります。もちろん、キナーゼの種類によるとは思いますが。そういう点で、反応停止としてもちいるのは危険でしょう。次に何をやるかによって反応停止法は変える必要があると思います。液体窒素を用いる場合でも、解凍の際にどうなるかが気になるのですが、次に酵素反応測定を行う場合だと悩みますね。

(無題) 削除/引用 No.1331-27 - 2008/06/17 (火) 09:23:31 - 通りすがり Y様 僕もY様と同意見でwashせずすぐにlysisしていました。 今のところ問題はないですがやはりwashはした方がいいとは思うのですが。 thyna様 cold shock signal pathwayで調べてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1331-26 - 2008/06/17 (火) 06:33:49 - Y Washによる機械（物理的）刺激、温度変化による刺激、操作を増やすことによる時間ロスを考えて、培地をアスピレート後、washせずにいきなりice-cold lysis bufferを加えるようにしていました。ただしこの場合、血清成分が完全に除けませんが、そんなに大きな問題ではないと思っていました。

(無題) 削除/引用 No.1331-25 - 2008/06/16 (月) 14:12:50 - thyna >通りすがり様 　ACCに関しては起こらない「かも」しれません。ただしtarget pathwayに影響を与えない可能性は否定できないというのが私の見解。いずれにせよ答えは既に出ていて、「コントロールと比較して・・」です。 「cold shock signal pathway」でいくつかのpathwayがでてきてるっぽいので必要なら見てみるのもいいかもです。

(無題) 削除/引用 No.1331-24 - 2008/06/16 (月) 00:16:53 - 通りすがり thyna様 大変よくわかりました。ありがとうございます。 そんなにacuteの反応が出てしまうんですね。 そのACCのリン酸化を見るのは当然37度ですよね。 では一般にlysate回収の際のcold PBSでのwashではそのようなリン酸化は厳密に4℃を守られている条件であれば、起こらない可能性の方がたかそうかなあと素人的には思います。いかがでしょうか？ もし低温という条件でなんらかの刺激が入るのはどのようなシグナル経路なんでしょうね。トピ主の方の質問に戻ってしまいましたね。すみません。

(無題) 削除/引用 No.1331-23 - 2008/06/15 (日) 13:05:20 - thyna 追記ですが、私たちのラボではグルコースを含まないDMEMで細胞を処理した場合、3分後からAMP-activated protein kinase substrateのリン酸化が認められること、またこれはリン酸化抗体の特異性の問題が排除できませんがsubstrateによってリン酸化が亢進する速度が異なる可能性があることを確認しています。

(無題) 削除/引用 No.1331-22 - 2008/06/15 (日) 12:48:09 - thyna >通りすがり様 　通常培養条件下からDMEMもしくはPBSへ培地を置き換え5分後にPBS回収＞液体窒素で凍結させた場合に、PBSのほうではDMEMと比較してAMP-activated protein kinaseのsubstrateであるACCのリン酸化が優位に増加しているというデータを見せてもらったことがあります。解糖系の阻害剤を使った場合では1分前後程度でシグナル系のリン酸化の変化があるそうです。またこのとき、栄養欠乏条件下から栄養豊富な条件へ変えた場合、5分でACCのリン酸化レベルの低下が認められていました。そういうわけで、最近は回収を液体窒素で行うようにしています。

(無題) 削除/引用 No.1331-21 - 2008/06/15 (日) 06:42:42 - おお ATPを消費する反応は低温でプロックされるので、温度を下げるということをよく行います。キナーゼの類もそうなのでしょうか、、、そうするとすぐに冷やした方がというのも分かる気がします。フォスファターゼの温度依存性も気になりますね。 ひとつ言えることは、細胞を溶解するような場合は37だから安心とか言うのではなくモタモタせずに早く溶解した方がいいかと思います。 で、見るものによって方法を変えないといけない場合もあるというのも事実です。各論はここで議論されているものをみれば一通り把握できますね。

(無題) 削除/引用 No.1331-20 - 2008/06/14 (土) 20:22:18 - L 細胞を扱ったことはないのですが、とても勉強になるトピックですね。 素人考えですが、以下のような手順はいかがでしょうか？ 細胞を段階的に無血清培地に馴化させた後、無血清培地で細胞を洗い、遠心して細胞をペレットにします。 このペレットにSDS Sample Buffer(IEF用のSBでもいいと思います)を加えて、boil(boilが不適な場合もありますが)して、 SDS-PAGE -> western blottingを行う PAGEのときに、無血清培地も一緒に流しておけば、培地由来のシグナルではないことが証明できると思います。

(無題) 削除/引用 No.1331-19 - 2008/06/14 (土) 20:08:18 - 通りすがり 通りすがりの者です。 thynaさん PBSの栄養飢餓誘導性による早いシグナルの動きについて教えて下さい。 実際PBSで3minくらいで入ってしまう刺激と言うのは具体的にどのような経路なのでしょうか。 とても気になります。ぜひ教えて頂けないでしょうか。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1331-18 - 2008/06/14 (土) 15:38:58 - imorin >[Re:16] thynaさんは書きました : > >imorinさん > 培養上清中の不純物というのであれば、37度に温めた培養液（血清抜き）でPBSの代わりにwashしてはどうでしょう？？　実験の目的にもよりますが、PBSによるシグナルの動きが気になるのであればそこまでやる必要があるかと思います。 > ちなみにPBSで起こる栄養飢餓誘導性のリン酸化の変化は3分ぐらいで変化が認められる経路があります。washも要注意です。 thynaさん、再び重要なご意見をありがとうございます。 リン酸化の変化は本当に早いものは早いので、難しいですよね。 私が今疑問に思っていることは、 「PBSの成分そのものによるシグナルの動き」 や、 「洗いの操作による物理的な刺激によるシグナルの動き」 や、 「洗いの操作時に用いるPBSの栄養飢餓誘導性による早いシグナルの動き」 等等 を抑制するための「冷たいPBS」が、本当に生きている細胞にとっての、シグナル全般的な停止になっているのかどうか？？もし冷却という操作に細胞が積極的に反応した場合、強烈な耐冷却のシグナルが入り、見たいシグナルの変化が消えてしまうのではないか？？という点です。 確かに、培養液で洗えば、PBSの成分によるシグナル変化は抑制できるのかもしれませんが、それ以外の要素については完全な解決策になっているのでしょうか？？ これという解決策が見つかる議論ではないことは分かっているのですが、一例でも良いのです。常温を積極的に用いている実験があればと思い、質問させて頂きました。 よろしくお願いいします。

(無題) 削除/引用 No.1331-17 - 2008/06/14 (土) 15:20:31 - おお > > >おおさん > 返信ありがとうございました。 > 野菜の謎かけの答えが分かりません。 > もしよろしければ、意味をお教えください。 生ものだと腐るというイメージですが、野菜だとひやして、鮮度を保つという印象なので、こっちのほうがあってるかなと思いました。生ものと書きながらちょっと失敗したなと思ってたので、、、 すいません具体的な議論をしてないですねわたし、、、、そのへんはみなさんにおまかせしておきます。

(無題) 削除/引用 No.1331-16 - 2008/06/14 (土) 14:02:14 - thyna >imorinさん 培養上清中の不純物というのであれば、37度に温めた培養液（血清抜き）でPBSの代わりにwashしてはどうでしょう？？　実験の目的にもよりますが、PBSによるシグナルの動きが気になるのであればそこまでやる必要があるかと思います。 ちなみにPBSで起こる栄養飢餓誘導性のリン酸化の変化は3分ぐらいで変化が認められる経路があります。washも要注意です。

(無題) 削除/引用 No.1331-15 - 2008/06/14 (土) 13:12:05 - imorin >[Re:13] thynaさんは書きました : > 私もそこはシグナル伝達を見る場合においては不安な点です。そこで私たちはdishからmedium除去をしたらdishごと液体窒素にいれて細胞を凍らせます。これによってシグナル系の変化を防ぐことができます。その後凍ったままのcellにprotease inhibitor, phosphatase inhibitorなどの入ったlysis bufferをかけてlysateを回収します。 thynaさん、大変参考になるご意見、ありがとうございます。 私も、洗いを省略して、dishごと液体窒素に浸すことは考えました。 しかし、培養上清中の不純物を除いて抽出したい場合、やはり洗いは欠かせないのではないかと思います。 やむを得ず洗う場合、冷たいほうがよいのか、常温（といいますか、厳密には細胞を飼っていた温度）が良いのか、こればっかりは両方試すしかないのかとは思いましたが、「この時は常温のほうがよかった！！」という例をご存知の方、お願いいたします。 >おおさん 返信ありがとうございました。 野菜の謎かけの答えが分かりません。 もしよろしければ、意味をお教えください。

(無題) 削除/引用 No.1331-14 - 2008/06/14 (土) 11:40:57 - おお >[Re:5] おおさんは書きました : > 話をややこしくすると、冷やさない方がいいという人もいます。 このコメントしてよかったと思いました。 > 生ものを冷蔵庫でひやすのと同じ感覚でしょうか "生もの" よりも野菜と言った方がわかり易かったかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1331-13 - 2008/06/14 (土) 11:25:59 - thyna 私もそこはシグナル伝達を見る場合においては不安な点です。そこで私たちはdishからmedium除去をしたらdishごと液体窒素にいれて細胞を凍らせます。これによってシグナル系の変化を防ぐことができます。その後凍ったままのcellにprotease inhibitor, phosphatase inhibitorなどの入ったlysis bufferをかけてlysateを回収します。 正直この辺のことを考えてないのか考えられないのかわかりませんが、安易に考えているのではないかというレスが多いのにびっくり。･･･研究者やめといたほうがいいのでは･･･

(無題) 削除/引用 No.1331-12 - 2008/06/14 (土) 11:10:25 - imorin qqさんとタイミングがほぼ被ったようですが、同じ考えの方がいらっしゃるようで安心しました。

(無題) 削除/引用 No.1331-11 - 2008/06/14 (土) 11:05:56 - imorin 返事が遅くなりましてすみません。 質問がいい加減すぎて、不快に思われた方が多いようです。 大変失礼しました。 結構深い意味で質問しています。 当方、タンパク実験が専門ですので、当然プロテアーゼやフォスファターゼ阻害のために冷やすことは承知しています。 ただ、質問の点は、抽出液の段階ではなく、まだ細胞が生きている段階での冷却処理についてです。 冷えたPBSで処理した場合、そのショックにより見たいシグナルが消えることもあるのではないのか？？と疑問に思ったからです。 返信を頂いた方の中に、「コントロールさえとっていればいい」という意見を頂きましたが、もちろん、仰るとおりです。 しかし、「このシグナル経路を見たい時は、常温のPBSの方が良い」 といような経験をお持ちの方がいらっしゃったらと思った次第です。 一般的に酵素の活性は低温で落ちますので、素直に考えれば、冷やしたほうが無難でしょうが、細胞がその冷却に「応答」した場合、見たいリン酸化経路等の活性が弱まったりすることはないのでしょうか？？ 改めてよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1331-10 - 2008/06/14 (土) 11:01:20 - qq そうそう、lysisし始める時に、氷上に移しますね。 皆様、誤解なさらないでくださいね。 何かの条件で処理した付着細胞のタンパクを抽出する時に、dishを氷上に置いて、冷えたPBSで洗うのを見ると、？？？と思ってしまうのです。 見たい条件の細胞を即座に良く冷えたLysis bufferで溶解・希釈するのがヨロシイでしょうと、思っているのです。 つまり、「氷上で冷やした細胞」のタンパクを抽出したいのではなく、抽出したタンパクを温めない事が要求されているのだと思っています。まあ、条件は兼ね合いなのですがね。

(無題) 削除/引用 No.1331-9 - 2008/06/13 (金) 21:09:14 - ami ･･･実験やめといたほうがいいのでは･･･ 外国の大学院では、２年間勉強だけを必死でやって、その後実験をするようなところもあります。

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