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(無題) 削除/引用 No.1332-9 - 2008/06/17 (火) 11:50:06 - おお > > 他の遺伝子導入試薬と比較した場合にFuGENE6は導入効率等を含めて、1〜5段階評価をした場合にどの程度に位置すると皆さんはお考えてでしょうか？それとも導入試薬の良い悪いは細胞によりけりなのでしょうか？ 評価としては私は1(数字が大きくなるほど悪いというスケールで)をつけてます。あとはインビトレジェンのリポフェクタミンの一番新しいのは試してないですが、うたい文句どうり毒性は低いようです。リポフェクタミンのシリーズもよく使かわれる細胞には結構効率よく入ります。QIAGENのEffecteneは発売された時、血清の影響を受けにくいと言う事で、血清を下げると分化してしまう細胞(C2C12)に使っていましたが、良好だったと思います。 お察しのとおり、一般論として細胞と試薬のコンビネーションで随分違うことはあります。

(無題) 削除/引用 No.1332-8 - 2008/06/17 (火) 10:26:20 - a いろいろご指導いただきましてありがとうございます。なぜノックダウン効果が見られないかをもう少しよく検討してみたいと思います。 もうひとつ皆様に伺いたいことがありまして、遺伝子導入試薬を変えると導入効率はかなり変化するものなのでしょうか？他の遺伝子導入試薬と比較した場合にFuGENE6は導入効率等を含めて、1〜5段階評価をした場合にどの程度に位置すると皆さんはお考えてでしょうか？それとも導入試薬の良い悪いは細胞によりけりなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1332-7 - 2008/06/15 (日) 14:20:07 - MK まずRNAiによるノックダウンが観察されない原因をもう少し詳しく調べると良いと思います。考えられることとしては、 1. 細胞に対するplasmidの導入効率が悪い 2. 設計されたRNAiの配列がノックダウンの作用を持っていない 3. RNAiの標的となるタンパク質が非常に安定であるため、RNAiでmRNAを減少させてもタンパク質に翻訳されているものが多量に残っており、検出されてしまう などです。 1.はGFPを発現するようなplasmidで検討が可能です。論文で使用されているような細胞とリポフェクション試薬の組み合わせでも、細胞の性質は培養された期間、場所によって結構変わってしまうものなので必ずしも高効率化はやってみないと分からないものだと思います。 2.は外注で作成した配列がノックダウンを実際に保証したものであるか、ある特定の計算方式によって何割以上かの確率でノックダウンの成功を保証したものであるかを調べる必要があります。 もし後者であれば自分で確認する必要があります。遺伝子導入効率がよい細胞にFLAG,HAなどのエピトープを付加した目的タンパク質を発現するベクターと、検討したいRNAiベクターを同時に導入すると、ある時間からの転写に対するRNAiの効きを検証できるので便利かと思います。 RNAi配列に問題が無くても導入効率があまりよくないようであれば薬剤による選抜を行わないとノックダウンが観察されないこともあります。 ベクターよりもsiRNAを導入する方式の方が細胞への導入効率がいいのでどうしても導入効率が改善されないようであればそちらも検討した方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1332-6 - 2008/06/14 (土) 15:14:25 - おお >[Re:4] aさんは書きました : > 何に基づいてうまくいっていないと判断しているかについてなのですが、ベクターをプロトコルに従って導入した後、目的タンパク質の機能、発現抑制について評価しました。その結果、抑制ができていないという状態です。 この時点では、うまく入っていないのか、入っているけど機能してないのかわからないですよね。入っていても機能してないのであれば、試行錯誤しても改善が認められるかどうかもわからないと思いませんか? 発現抑制はウエスタンで行ったと言うことでしょうか、全く落ちないのか、ちょっとしか弱くならないのかどっちでしょうか。 > pBAsiベクターはタカラバイオ社から販売されているベクターです。shRNA配列設計、ベクターの構築は外注で構築しました。 でタカラさんは、設計して構築しただけですか?それとも何かの系でノックダウン出来ることを確認していますか?もししてない場合は、トランスフェクションの効率がよくてそれでもワークしないという状態でフリーとか割引で再構築してもらえる余地があるなら、トランスフェクションの効率を把握しておかないと交渉できませんよね。 あとプロモーターはマウスU6でしょうか?それなら問題がないと思います。 昔マウスU6が先行でこの手のベクターは売り出されましたが、人では発現せず、人ようにヒストンプロモーター(だったと思う)のものが売り出されるようになったという経緯があります。で人ようのものがマウスでどの程度ワークするのかなとふと思いました。それがプロモーターを聞いた理由です。 少なくともGFP発現ベクターなどで、最適な条件で行っているか、効率に改良の余地がないかなど調べた方がいいと思います。あと、ノックダウンをみる時期も重要です。遺伝子がシャットダウンされてから、タンパクが枯渇するまでに幾らかタイムラグがあるといわれてます。siRNAではそのためある間隔をおいて、2ど処理したりというのもあります。全体的に導入はされているが、いまいちききが悪い時は同様のてが取れるかもしれません。 あと,血清濃度が低いほうが入りやすいです。

(無題) 削除/引用 No.1332-5 - 2008/06/14 (土) 14:45:20 - window 文献からその細胞とFugeneで遺伝子導入をしているものがあっても、それが実際に効率の良いもの、最適なものかどうかはわかりません。 もちろんそのような報告が多数ある場合は間違いないと思いますが。 まずはＧＦＰ発現ベクターなどで遺伝子導入効率の検討、条件が決まり次第、shRNAのベクターを導入してみてはいかがでしょうか？ 基本的なことですが、shRNAベクターを初めて使用しているのであれば、他の遺伝子ですでにうまくいくことがわかっているshRNAのベクターを作成して実際にノックダウンできるかどうかポジティブコントロールとしたほうが良いと思います。

アドバイスありがとうございます。 削除/引用 No.1332-4 - 2008/06/14 (土) 14:16:18 - a 何に基づいてうまくいっていないと判断しているかについてなのですが、ベクターをプロトコルに従って導入した後、目的タンパク質の機能、発現抑制について評価しました。その結果、抑制ができていないという状態です。 pBAsiベクターを使用したFuGENE6での遺伝子導入は文献上での報告が見られました。また、FuGENE6でのB16細胞への遺伝子導入についても文献上での報告が見られました。pBAsiベクターをB16細胞で導入している報告は見られませんでした。 これらpBAsiベクターを導入している文献やB16細胞に遺伝子導入を行っている文献の方法を参考にしようと考えましたが、「使用書に従って行った」との記載のみで、残念ながら参考にすることができませんでした。 pBAsiベクターはタカラバイオ社から販売されているベクターです。shRNA配列設計、ベクターの構築は外注で構築しました。

(無題) 削除/引用 No.1332-3 - 2008/06/14 (土) 11:50:22 - おお 何に基づいてうまく入っていないと判断しているのでしょうか?pBAsiのプロモーターは何種類かありますがどれを使っているのでしょうか。導入したshRNAは自分で設計したものでしょうか、何かほかの実験で効果があることが示されているでしょうか、、、、、 何に基づいてうまく入っていないかと言うのがまずは気になります。

(無題) 削除/引用 No.1332-2 - 2008/06/13 (金) 21:41:33 - window とりあえずトランスフェクション効率の良い条件検討からしたほうが良いと思います。 個人的な経験ではFugeneは２９３などにしかあまりむいてないと思います。 リポフェクタミンあたりが無難です。

B16細胞への遺伝子導入について 削除/引用 No.1332-1 - 2008/06/13 (金) 17:15:42 - wai shRNA発現ベクターをB16細胞に対して導入を試みているのですが、うまい具合に入ってくれません。導入試薬はFuGENE6を使用しており、前培養を24時間行った後に、使用書のプロトコルに従ってリポプレックスを作成し、培養液中に滴下しています。使用ベクターはマウスU6プロモーターのpBAsiベクターを使用しています。遺伝子導入経験のある方、何か参考になることがありましたらアドバイスいただけないでしょうか？よろしくお願いいたします。

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