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解決 削除/引用 No.1502-13 - 2008/07/29 (火) 14:58:39 - 管理人 発言者より解決済みとのことです。

(無題) 削除/引用 No.1502-12 - 2008/07/29 (火) 14:18:10 - こーちん 返答が遅くなり大変申し訳ありませんでした。 ひまわり 様 ご返答有難うございます。 私が使用しているカラムは市販のものではなく、特注で作ってもらったものなのだそうです。 なので、どのようなカラムに近いものなのかも、ちょっと解りませんでした。 おお 様 界面活性剤の情報を有難うございました。 今回の試験には用いることはできませんが、良い勉強になりました。 これを機に有機溶媒や界面活性剤のほうの勉強を広げたいと思います。 以上でこのトピックは「解決」としたいと思います。 ご親切にご教授くださった皆様、有難うございました。

肝細胞からのﾘﾎﾟﾀﾝﾊﾟｸ抽出方法 削除/引用 No.1502-11 - 2008/07/08 (火) 15:28:58 - こーちん ひまわり様 ご返答有難うございます。 カラムは特注で作ってもらったらしく、詳細は教えてもらえませんでした。 ＞cell pelletを50%アセトニトリルに溶かして 50%アセトニトリルですか。。 結構な高濃度になりますね。 ﾘﾎﾟﾀﾝに影響があるかどうか、一度検討実験してみようかと思います。 それをカラムにかけられるかどうか、、というのが問題なのですが、こちらもまずは劣化気味のカラムを使用して、pre実験をしてみたいと思います。 あまり細胞からﾘﾎﾟﾀﾝを抽出し、HPLCにかけるという症例は少ないみたいで、実践してみて検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1502-10 - 2008/07/08 (火) 15:14:57 - おお >[Re:8] こーちんさんは書きました : > 界面活性剤を使えない大きな理由として、 > ・カラムを壊す 界面活性剤それ自身ではカラムは壊れないです。 でもサンプル自身に影響があるようでは仕方ないですね。

(無題) 削除/引用 No.1502-9 - 2008/07/08 (火) 15:01:54 - ひまわり HPLCのカラムは何を使っていますか？ cell pelletを50%アセトニトリルに溶かして、逆相ODSカラムを使って50%〜80%アセトニトリル、流速1.0mL/minで飛ばして分離できるのではないかと思います。 細胞数にもよると思いますが、シグナルは弱いかもしれません。

肝細胞からのﾘﾎﾟﾀﾝﾊﾟｸ抽出方法 削除/引用 No.1502-8 - 2008/07/08 (火) 13:57:59 - こーちん えー 様 ご返答ありがとうございます。 URL有難うございます。 早速問い合わせてみたいと思います。 ＞質問の趣旨からは外れるとは思いますが、 ＞「細胞内のリポタンパクを定量したい」ということですので、 ＞アポタンパクをウェスタンとかELISAに持っていく・・・とか そうですね、サンプル量を考えるとそちらの方が少量で済みそうですね。 ﾘﾎﾟﾀﾝを細胞から抽出できたとしても、HPLCにかけるとしたらそれなりの濃度と量が必要になってきますから、気にしていた所です。 おお 様 ご返答有難うございます。 セファデックスの情報有難うございました。 URLの内容と共に、是非参考にさせていただきます。 ＞ミセルの大きさを気にしているのでしょうか? 界面活性剤の特徴や影響にあまり詳しくないので、返答内容が検討違いでしたらご了承下さい。 ミセルの大きさを気にしているわけではないです。 界面活性剤を使えない大きな理由として、 ・カラムを壊す ・ﾘﾎﾟﾀﾝを壊す（分離中に） という理由を聞いています。 実際に使用している溶離液に入っているBrij（界面活性剤の一種）は低濃度で使用していて（全く界面活性剤が測定に含まれていないというわけではありませんでした。誤解を招いて申し訳ありません）、検討では0.04％までは使用できるということでした。それ以上になると、ﾘﾎﾟﾀﾝのピークに界面活性剤が被ってきてしまい、私の実験には使用できませんでした。 ＞ミセルの小さい界面活性剤 どういったものなのか、不勉強で申し訳ありません。 早速調べてみたいと思います。 ご教授有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.1502-7 - 2008/07/07 (月) 21:54:38 - おお セファデックス担タイ自体は1M酢酸、8Mウレア、6Mグアニジン酸、24%エタノール、30%いそぷろぱのーる、30%アセトニトリル存在かでも使用可能です。 http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/chrgfc/56119096ac.pdf GEもう少し詳しい情報もGEホームページ内にあるかもしれません。 >界面活性剤が入っていたらHPLC（カラム：セファデックス）にかけられなくなってしまいます。 これはミセルの大きさを気にしているのでしょうか?でしたら、ミセルの小さい界面活性剤をつかえばいいかと思います。シグマカタログやホームページに界面活性剤の性質が載った一覧表とかありますのでそれを参照するといいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1502-6 - 2008/07/07 (月) 21:50:56 - えー http://www.lipo-search.com/index.html こんな会社ありました。問い合わせてみるのも面白いかもしれません。 質問の趣旨からは外れるとは思いますが、 「細胞内のリポタンパクを定量したい」ということですので、 アポタンパクをウェスタンとかELISAに持っていく・・・ 　とか セファデックスの耐溶媒性が気になるなら、 サイズ排除のシリカゲルとかをカラムに充填する・・・ 　とか（溶媒がリポタンを溶かす？バラバラにするのかもしれないけど）

肝細胞からのﾘﾎﾟﾀﾝﾊﾟｸ抽出方法 削除/引用 No.1502-5 - 2008/07/07 (月) 18:01:30 - こーちん 名無し 様 ご返答ありがとうございます。 通常は血漿や血清から分画を分離しているのですが、今回は培養細胞の中にあるﾘﾎﾟﾀﾝの濃度を計測するため、HPLCにかけ、分画を定量したいと考えております。 細胞破砕には、通常サンプルに含まれない有機溶媒が多く提唱されていたのですが、有機溶媒はカラムに悪影響を及ぼすと聞いているので、それ以外でﾘﾎﾟﾀﾝを壊さない方法で細胞破砕し、ﾘﾎﾟﾀﾝを抽出できる方法を探しております。

(無題) 削除/引用 No.1502-4 - 2008/07/07 (月) 17:40:02 - 名無し 血漿からHPLCあるいは超遠心でHDLやHDLやVLDLなどを精製する方法がありますから、それに準拠してみたらどうでしょうか。生化学実験講座シリーズに方法は出ていたと思います。

肝細胞からのﾘﾎﾟﾀﾝﾊﾟｸ抽出方法 削除/引用 No.1502-3 - 2008/07/07 (月) 17:27:28 - こーちん おお様 ご返答ありがとうございます。 有機溶媒をカラムに流すと、カラムが壊れてしまうので、使える有機溶媒を選抜する検討は行っていませんでした。 また、使用している溶離液（酢酸とTris、Brijを混ぜているもの）以外を流したこともありません。 なので、何が大丈夫という検討は行っていないのが現状になります。 過去に、「このカラムにはこの有機溶媒を使用した」という事例などがあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1502-2 - 2008/07/07 (月) 16:25:39 - おお 有機溶媒で使えるものはないのでしょうか。エーテルとか、、、

肝細胞からのﾘﾎﾟﾀﾝﾊﾟｸ抽出方法 削除/引用 No.1502-1 - 2008/07/07 (月) 16:18:46 - こーちん 培養細胞（肝細胞）から、細胞中に蓄積しているﾘﾎﾟﾀﾝﾊﾟｸ質を抽出し、濃度をHPLCにて分画定量したいと考えております。 界面活性剤やホモジナイザーでは、細胞と一緒にﾘﾎﾟﾀﾝも破壊してしまいますし、界面活性剤が入っていたらHPLC（カラム：セファデックス）にかけられなくなってしまいます。 どなたか良い方法をご存知の方がいらっしゃいましたら、ご教授お願いいたします。

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