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途中でした(^^;) 削除/引用 No.1580-10 - 2008/07/25 (金) 16:25:42 - ゆん >[Re:9] ゆんさんは書きました : > こんにちわ． > > > レーザーマイクロダイセクションにてRNAを抽出し、RT-PCRを行っていますが > > 標的のRNAのプライマーを用いたものではバンドが出るのですが、内在性コントロールとして用いたGAPDHではバンドが出ないことがあります。 > > 同じくArcturusのダイセクションを使用しています． > QIAGEN RNeasy Micro Kitで抽出していますがこれまで特に問題はありません． > targetでバンドが出るなら，恐らく抽出よりもRT-PCRのワークの問題でしょうね． > 途中で投稿してしまいました．すみません． 市販プライマーを何度か使用しましたが，必ずしも反応性が良いというわけではなさそうです．まずはプライマーを変更されるのが早いと思います．他のHouse Keeping遺伝子でも良いと思います．

プライマーno 削除/引用 No.1580-9 - 2008/07/25 (金) 16:20:11 - ゆん こんにちわ． > レーザーマイクロダイセクションにてRNAを抽出し、RT-PCRを行っていますが > 標的のRNAのプライマーを用いたものではバンドが出るのですが、内在性コントロールとして用いたGAPDHではバンドが出ないことがあります。 同じくArcturusのダイセクションを使用しています． QIAGEN RNeasy Micro Kitで抽出していますがこれまで特に問題はありません． targetでバンドが出るなら，恐らく抽出よりもRT-PCRのワークの問題でしょうね．

トリゾルは使えません 削除/引用 No.1580-8 - 2008/07/24 (木) 22:07:46 - かよ LCM capからのＲＮＡ抽出にトリゾルは使えません。 PicoPure kitもRiboAmp もArcturusが出してますので、間違いなくうまくいきますが、いかんせん高いです。私はＨＳcapで１００スポット以下ならPicoPureを使いますが、通常は収量を増やす（スポット数を増やす）方を選びます。PicoPureはcapの上にisolation solutionを１０ulのせるというような方法で、ほんとに微量の抽出キットです。メーカーに問い合わせば詳しく教えてくれるでしょう。 ちなみに、私はStratageneのＲＮＡisolation kitを使っています。良好に抽出され、これまでＲＮＡがとれなかった、ＰＣＲで何にも出なかった、というようなことはありません。

(無題) 削除/引用 No.1580-7 - 2008/07/24 (木) 18:57:09 - ぴ ＲＮＡの抽出はＡｍｂｉｏｎ社のＲＮＡ-queous　Microキットを使って、cDNAの合成はTaKaRano逆転写酵素を使って通常の方法で行っています。ＬＣＭのマシンはArcturusです。 in situも同時並行で行っておりますが、手技として確立したいと考えています。 組織を打ち抜いたキャップごとトリゾール法でRNAを抽出することはできるのでしょうか？ 検体をふやしてスポット数をかせごうとも考えてますが収量を増やすためにトリゾールでもできるなら試してみたいと考えているのですが。 PicoPureキットというのは名前からするとMicroキットよりもLCMには適しているのでしょうか

ＲｉｂｏＡｍｐ 削除/引用 No.1580-6 - 2008/07/17 (木) 13:11:15 - かよ ArcturusはRiboAmpというＲＮＡ増幅キットを出しています。私の実験系では必要ないので買ったことはありませんが、良好に増えるようです、聞いたところでは。 私はＬＣＭサンプルに関してはリアルタイムＰＣＲしかやったことありませんが、内部コントロールが３５サイクル以上で出てくるような状態だと、ターゲットはまずdetectできませんね。 ＲＮＡの抽出とcDNAの合成はどのようにされていますか？ＬＣＭのマシンはArcturusでしょうか。微量の場合はPicoPureキットもありますが、そのようなキットを使っていらっしゃいますか？ それから、定量が目的でなければ、in situでもいいように思うんですが、いかがでしょう。

Re: 削除/引用 No.1580-5 - 2008/07/16 (水) 23:43:49 - UC こんにちは。 >内在性コントロールとして用いたGAPDH その組織では、GAPDHはリッチで、その組織での発現量 はほぼ一定であるというデータは予めあるのでしょうか。 GAPDHが確認できるサンプル間でのばらつきはありませんか。 >35サイクルで行っているのですがこれを40サイクルに増やして >バンドがでればGAPDHも発現が確認できたということにしても >よいでしょうか？ コントロールとして用いたのに、35サイクルで検出できない のは、実験系がワークしていないと考えるべきでしょう。 リッチなら、20サイクルも回せば見えると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1580-4 - 2008/07/16 (水) 22:22:47 - ぴ ありがとうございます。 GAPDHのプライマーは自作のもので出なかったので既製品を購入して使いました（既製品なのでイントロンは当然挟んでいるものと考えてました。添付文書で確認してみます）。 PCRの目的が、定量比較ではなく、目的の組織に目的のRNAが発現しているかどうかの確認のためですので、realtimeではなくアガロースでのバンドの確認を考えています。 スポットは100よりは少ないと思います。 感度の問題であれば現在35サイクルで行っているのですがこれを40サイクルに増やしてバンドがでればGAPDHも発現が確認できたということにしてもよいでしょうか？ またRNA増幅法というのを具体的におしえていただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1580-3 - 2008/07/16 (水) 21:25:09 - TK-1 > レーザーマイクロダイセクションにてRNAを抽出し、RT-PCRを行っていますが > 標的のRNAのプライマーを用いたものではバンドが出るのですが、内在性コントロールとして用いたGAPDHではバンドが出ないことがあります。 標的のプライマーはイントロンを挟んでいますか？ > こういう場合、GAPDHが出ない時点でRNAの抽出、もしくはRTなどになんらかの不備があったと考えるべきでしょうか。 標的のプライマーで見ているものがRNA由来のものであればRNA prepの問題というよりGAPDHのプライマーの感度の問題かも知れません。GAPDHんプライマーでもっと感度の良いものがあるかもしれませんし、他にもポジコンとなるプライーマーはあるのでそういったものを試せばいかがですか。

リアルタイムでやってますが 削除/引用 No.1580-2 - 2008/07/16 (水) 21:22:18 - かよ わたしはＬＣＭのサンプルはリアルタイムＰＣＲで解析していますが、内部コントロールが出なかったという経験はありません（ただし私は１８ｓＲＴを使っています）。細胞数あるいはスポット数でどの程度採取されていますか？また、ＲＮＡの抽出はどんなキットでされていますか？私は通常１００〜２００スポットの採取で問題なく解析していますが、シングルセルとかいうレベルだと提供できる情報は全然ないです。 まあＲＮＡ量があまりにも少ない場合はＲＮＡを増幅するのも手ですよね。

微量のRNAからRT-PCRをした際の内在性コントロール 削除/引用 No.1580-1 - 2008/07/16 (水) 20:37:14 - ぴ お世話になります。 レーザーマイクロダイセクションにてRNAを抽出し、RT-PCRを行っていますが 標的のRNAのプライマーを用いたものではバンドが出るのですが、内在性コントロールとして用いたGAPDHではバンドが出ないことがあります。 こういう場合、GAPDHが出ない時点でRNAの抽出、もしくはRTなどになんらかの不備があったと考えるべきでしょうか。 ちなみに標的にしたものでは発現していない組織をテンプレートにしたものでは（ネガコン）きちんとバンドが出ていません。 またPCRプライマーもきちんとワークしていたものを使っています。 わかりにくい文章でもうしわけありませんがよろしくお願いします。

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