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ありがとうございます！ 削除/引用 No.1593-8 - 2008/07/21 (月) 23:03:36 - transplant ~ さんのご指摘どおり、2倍量のAPS,TEMEDでうまくいきました！ ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1593-7 - 2008/07/21 (月) 20:07:23 - transplant アクリルアミド溶液 →３５％程度の購入したストックから作っています。（開封日時不明なので怪しいですが、大丈夫なときもあったのでまだ大丈夫かなと） APS →もちろん毎回調製です。 気温 →今まで特に気にしていなかったのですが、うまくいった時は冬だったような気がしたので。。。と言ってもエアコン完備の研究室ですし見当違いだったのかもしれません（苦笑 APS、TEMEDを多めにですか… 要は、重合反応のスピード上げて阻害される前に固めてしまえと言うことですよね？ 今、まさに作ってる所なのでやってみます！

しちみさんへ 削除/引用 No.1593-6 - 2008/07/21 (月) 19:58:05 - transplant SDS-PAGEの装置および機器を使って、TBE-ポリアクリルアミドゲルで泳動しているだけです。 TBEバッフアーをベースに、２０−３０％程度のアクリルアミドゲルを作製。 SDS-PAGEと同じようにセットして（泳動バッファーは1×TBE）、サンプルは普通の6×ローディングダイ等で調製。泳動後はEtBrで染色して撮影。（他の染色でもいけると思いますが） 核酸分離なのでスタッキングゲルは使っても使わなくても問題ないと思いますが、（2ゲル方式のほうが多少分離がいいような気がするので）スタッキングゲルを使う方にしています。

(無題) 削除/引用 No.1593-5 - 2008/07/21 (月) 19:45:38 - ~ >久しぶりにゲルを作ってみました。 アクリルアミド溶液は新しく作り直したのでしょうか？ それとも以前使っていたものをそのまま使用したのでしょうか。 プロトコルは以前と同じでしょうから、 違いがあるとすれば、試薬だと思います。 （さすがにAPSは粉末から新しく溶かして使っていますよね） APSとTEMEDを2倍量入れたら、縮む前に固まりませんか？ スタッキングゲルに目に見えるムラが生じたときや、 ウェルの上部がコームの形に四角くならずに、丸まったとき(こちらがTransplantさんの例に近い？)には、 APSやTEMEDの量を増やしたら改善しました。 >重合させる時の温度などが関係あるのでしょうか？ 温度を気にされていますが、特におかしな気温で作成していたのですか？ そうでなければ、試薬や手順のほうが気になります。

(無題) 削除/引用 No.1593-4 - 2008/07/21 (月) 19:29:10 - しちみ ポリアクリルアミドゲルの重合反応は意外と熱が出ます。 スラブゲルなら重合時に水槽に浸からせてしまうと綺麗なゲルができます。 ところでDNAの電気泳動ですよね？ サブマリンではなくてスラブゲルですか？ スタッキングゲルを使うDNA用のシステムのようですが、不勉強のためしりません。後学のため教えてください。

えーと… 削除/引用 No.1593-3 - 2008/07/21 (月) 17:34:36 - transplant ウェル、コームの付近ではなく、全体的にゲルの容積が目減りしているように見えます。（見方によれば水が出すぎてるとも言えるかもしれません） ちなみにランニングに比べてスタッキングは若干薄めになっています。 量ですが、重合前にはコームから溢れるくらい満たしていても、固まると浅いウェルができるくらいの量になってます。 コームはプラ製でなくＰＴＦＥ？ＰＶＤＦ？製だと思います（白くて撥水＋ツルツルした素材なので） 減圧によるエア抜きもやっています。

(無題) 削除/引用 No.1593-2 - 2008/07/19 (土) 14:20:49 - 中年 収縮が原因なのは確かですか？コームの素材によっては目に見えないくらいの気泡を沢山抱え込んでいるので、ウエルの近くでは重合が進まなくて固まりにくいこともありますよ。

PAGEゲルが縮む… 削除/引用 No.1593-1 - 2008/07/18 (金) 18:38:40 - Transplant 300bp〜310bp程度の短いフラグメントの分離にPAGEを使おうと思い、久しぶりにゲルを作ってみました。 が、やけに重合時の収縮具合が大きく、深くて四角いウェルが出来ません。 重合させる時の温度などが関係あるのでしょうか？ 使用する液体の温度はすべて室温、bufferはTBE、１５％−２０％のアクリルアミドのゲルです。

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