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すみませんでした 削除/引用 No.1597-8 - 2008/07/24 (木) 22:44:09 - kenkyuu そのようなプロの方々のサイトと知らず質問していました。 頑張って自分で調べて考えたいと思います。いつか自分が研究者になって行き詰ったことがあれば、また是非利用させてください。

(無題) 削除/引用 No.1597-7 - 2008/07/24 (木) 20:02:21 - ~ > 毎回やる実験ではなんとなくライゲーション処理はあった方が、CIAP処理はなかった方が形質転換効率がいい気がするので 毎回何の実験をやるのですか？ ライゲーションが合った方がいいいうことは、あるか無いかを選択する余地があるのですか？ ライゲーションしなくていいのであれば、酵素代分安くなりますよ。 プレート2,4で、それぞれ10個のコロニーを拾った時、インサートの入っている当たりのコロニーがそれぞれ何個ずつあることが期待されますか？

(無題) 削除/引用 No.1597-6 - 2008/07/24 (木) 19:40:29 - director 少々、叱言を書かせてください。よく読んで理解してください。 あなたが行った実験は、何か新しいことを解明したり発見したりするためではなく、その実験自体の原理を学ぶための実験（ある意味「実習」のようなもの）だと思います。その結果をふまえてよく考え、場合によっては教科書や辞書を調べて「ある操作からどのような原理で特定の結果が導かれたのか」を理解しなければ意味がありません。�@や�Aの実験を行うとどのような原理でどのような結果になるかというのはすでにわかっていることで、その予想どおりの結果を導く技術や知識があなたに備わっているかを確かめる、あるいはそれらを身につける目的もあります。 答えが一連の説明として掲載された書物はたくさんあります（プラスミドを用いたクローニングを行う上でとても重要な知識ですから）。ここで質問し、多くの方から断片的な答えを集めて理解しようとするのは、行った実験を理解する道筋から外れていると思いますよ。ここは、前例の少ない実験や研究で行き詰まったり迷ったりしても書物などでは答えの得られないときに、経験者のアドバイスを求める場所です。

(無題) 削除/引用 No.1597-5 - 2008/07/24 (木) 18:25:59 - kenkyuu lac Z欠損遺伝子であることよくわかりました。ありがとうございます。 話は飛びますが形質転換効率（プラスミドが組み込まれる大腸菌数）はライゲーションやCIAP処理に左右されるでしょうか？ 一般的に線状でも環状でも取り込み率は変わらないが、ゲノムDNAと相同性をもたないプラスミドは、2本鎖あるうちの1本しかとりこまれず、形質転換効率が悪いということは聞きましたが、そのほかに転換効率についてはあまり聞きません。 しかし、毎回やる実験ではなんとなくライゲーション処理はあった方が、CIAP処理はなかった方が形質転換効率がいい気がするのでなにか関係あるのかなと思うのですが…

(無題) 削除/引用 No.1597-4 - 2008/07/22 (火) 09:55:59 - ~ >根本的な話ですが、pUC19上のlac Z遺伝子は欠損遺伝子ですか？ 単体で酵素活性を持たない欠損遺伝子です。 Alpha peptide部分(N末側)だけなので、 http://seq.yeastgenome.org/vectordb/vector_descrip/COMPLETE/PUC19.SEQ.html ωフラグメントを発現している大腸菌でないと、セレクションはかけられません。 http://www.uvm.edu/~mcase/courses/chem258/lecture5.pdf

ありがとうございます 削除/引用 No.1597-3 - 2008/07/22 (火) 04:24:50 - kenkyuu ＞フレームシフトが"起きず"に 誤字でした。フレームシフトが起きないのでβ活性を示すのですよね。すみませんでした。 根本的な話ですが、pUC19上のlac Z遺伝子は欠損遺伝子ですか？（無知ですみません） >消えたバンドは4361bp 存在は知っていたのですが、泳動に関係することを知りませんでした。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1597-2 - 2008/07/19 (土) 19:07:30 - ~ >3の倍数の塩基数であれば、フレームシフト変異がおこってβ‐ガラクトシダーゼが作られる -NNN-NNN-NNN- -NNN-NNN-NNN-NNN- というベクターに、3の倍数の塩基数のインサートを入れると、 -NNN-NNN-NNN-nnn-nnn-nnn--NNN-NNN-NNN- となります。 そのためフレームシフトが"起きず"に、活性のあるタンパク質ができる場合があります。 >後、プレート２、３、５では白が０でないのはなぜですか。 ５だけが"ライゲーション反応とCIAP未処理"で、他が全てライゲーションしているのですよね？ 2は別にインサートが入ってライゲーションされてもおかしくない条件ですよね。 ３は、たまたま末端が削れたものかもしれませんし、他のサンプルのコンタミかもしれません。得られた白コロニーの制限酵素地図などで分かると思います。 ５は青は切れ残りで、白はどこかのサンプルのコンタミじゃないですかね。 >消えたバンドは4361bp cosサイトについてまだ調べていませんか？

大腸菌形質転換実験について 削除/引用 No.1597-1 - 2008/07/19 (土) 18:19:46 - kenkyuu �@λDNAを組み込んだpUC19プラスミドをコンピテントセルに組み込み、X-galプレートで培養したところ、以下のように青コロニーと白コロニーができました。(制限酵素はプラスミド、λともにHind�Vを用いました。) プレート１　CIAP未処理のベクター　　　　　　　　 　青７９　　白０ プレート２　CIAP未処理のベクターとλDNAの混合物　　 青１０３　白６ プレート３　CIAP処理済のベクター　　　　　　　　　 青１７　　白１９ プレート４　CIAP処理済のベクターとλDNAの混合物　　 青２０　　白７２ プレート５　ライゲーション反応とCIAP未処理Hind�V消化pUC19　 青７７　　白１２０ 白コロニー→β‐ガラクトシダーゼ活性がなくなった大腸菌→pUC19にλDNAが組み込まれた大腸菌であることは理解できました。 しかし、実験補足で「λDNAの塩基対数が3の倍数ならば、たとえλDNAが組み込まれてもβ‐ガラクトシダーゼ活性をしめす」とありました。 これは、3の倍数の塩基数であれば、フレームシフト変異がおこってβ‐ガラクトシダーゼが作られるということでしょうか。 また、LacZ遺伝子はα相補性をもち、αレセプターとαドナーがばらばらでも二つそろえばβ‐ガラクトシダーゼを作れるとも聞きましたがこれも関係しているのでしょうか。 後、プレート２、３、５では白が０でないのはなぜですか。 �AλDNAをHind�Vで１時間消化したものと１晩消化したものを２つ用意し、EtBrで染色しアガロース電気泳動しました。結果、１時間消化のものは６つ、１晩消化のものは５つバンドが出ました。 １晩消化の方が制限酵素が働き、本来バンド数はふえるとおもうのですが、なぜ１晩消化のものが１つバンドが消えたのでしょうか。尚、消えたバンドは4361bp、λDNAの一番端でした。

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