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ゲルからのバンドの切り出しとシークエンスについて トピック削除
No.1600-TOPIC - 2008/07/21 (月) 12:08:51 - tigers
バンドの切り出しについてお伺いしたいことがあります。現在AFLPマーカーをＳＴＳ化するためにマーカーのシークエンスを読みたいと考えています。
・ポリアクリルアミドゲルで分画・マーカー部分のゲルを切り取り・ゲルからDNAを抽出・TAクローニング・プラスミド抽出の順で行いました。抽出したプラスミドはＰＣＲによってインサートを増幅しポリアクリルアミドゲルによって確かにインサートがAFLPマーカーの長さに一致するらしいことまでは確認しシークエンスを読みました。ただ読んだ配列が正しいものなのか（ＡＦＬＰ　マーカーの配列を読めているのか）自信がもてません。というのもポリアクリルアミドゲルの分画によってインサートの長さがＡＦＬＰマーカーと同じサイズに出てきたプラスミドでもインサートの配列が異なるものが出てきてしまったのです（シークエンスを読んだところ3ｂｐほど長さに差がありました）。ポリアクリルアミドゲルによる分画だけではＡＦＬＰを切り出せているかどうかの確認としては不十分でしょうか？どのようにして皆さんが確認されているのか宜しければ教えてはもらえないでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.1600-2 - 2008/07/21 (月) 12:50:40 - おお
まず、あなたがきりだしバンドに2つ(以上の)PCRフラグメントを含む可能性がありますね。2個体でしらべてある個体ではなく、たの個体ではその両方が増えてくるようなら、両方がのフラグメントがマーカーであるともいえます。アーティファクトの可能性をかんがえるなら、その配列からゲノムの配列をしらべるのが はやいと思いますが、、、、

ゲルからのバンドの切り出しとシークエンスについて 削除/引用
No.1600-1 - 2008/07/21 (月) 12:08:51 - tigers
バンドの切り出しについてお伺いしたいことがあります。現在AFLPマーカーをＳＴＳ化するためにマーカーのシークエンスを読みたいと考えています。
・ポリアクリルアミドゲルで分画・マーカー部分のゲルを切り取り・ゲルからDNAを抽出・TAクローニング・プラスミド抽出の順で行いました。抽出したプラスミドはＰＣＲによってインサートを増幅しポリアクリルアミドゲルによって確かにインサートがAFLPマーカーの長さに一致するらしいことまでは確認しシークエンスを読みました。ただ読んだ配列が正しいものなのか（ＡＦＬＰ　マーカーの配列を読めているのか）自信がもてません。というのもポリアクリルアミドゲルの分画によってインサートの長さがＡＦＬＰマーカーと同じサイズに出てきたプラスミドでもインサートの配列が異なるものが出てきてしまったのです（シークエンスを読んだところ3ｂｐほど長さに差がありました）。ポリアクリルアミドゲルによる分画だけではＡＦＬＰを切り出せているかどうかの確認としては不十分でしょうか？どのようにして皆さんが確認されているのか宜しければ教えてはもらえないでしょうか？
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