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(無題) 削除/引用 No.1605-10 - 2008/07/26 (土) 12:10:29 - カナマイシン 今度はSanger法を叩くかっこうになってしまいましたので弁護しますと（笑） やはりSanger法に頼らないと読めない配列にも遭遇します。 ゲノム解読をメインに行っているとある研究所も、 キャピラリ式マシンがメインといえどもやはり ゲル型のも数台は稼働している、とのことでした。 AP様、コメントありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1605-9 - 2008/07/26 (土) 12:07:39 - カナマイシン >AP様 コメントをいただいていたのにレスポンス遅れて申し訳ありません。 ・「Hi-Dye」の件 deionized formamideも奥が深いのですね… 単純なものだから各社に差はない、と思っていました。 グレードが高い上に価格が安いのならば、試してみる価値は大きいですね。Hi-Dye。 ・CEQ, ABI, Sanger ちょっとこれまでの流れではCEQを叩いてしまったように見える感があるので 訂正させていただきますと、CEQも非常に優秀なマシンです。 古典的Sanger法の苦労はよく知っています。 しかも読むほとんどがGCリッチな配列だったので地獄でした。 やはり目（というか「勘」）と経験で判断せざるを得ず、 「これがサイエンスといえるのか」とブルーになった頃もありました。 それに比べると、CEQ、非常に安定してます。だからこそ、稀にAだけぜんぶスペーシングが 微妙にずれているような現象に遭遇すると、とてもフシギに思うわけです。 各塩基のDyeにどんな物質が使われているかがわかれば、 安定性やその吸収波長から、どんな作業がトラブルのもとになるのか、 どんなものの夾雑がいけないのか、などなどわかると思ったのですが。 そこはやはり企業秘密情報みたいですね。

(無題) 削除/引用 No.1605-8 - 2008/07/23 (水) 11:59:04 - AP >「Hi-Dye」と謳っているからには改良が加えてあるのではないでしょうか。 これもdeionized formamideそのものらしいですが、グレードが特に高いもののようです。うっかりふつうのdeionized formamideをつかうと、全体的にピークが低くなり、プライマーから遠い配列が読めなくなります。

(無題) 削除/引用 No.1605-7 - 2008/07/23 (水) 11:44:38 - AP ABIのキャピラリーシークエンサーを使っていますが、配列による読み違いは驚くほど少ないです。 古典的なSanger法だとどうしても、ある配列（たとえばGG, GT, CCなど)で、最初のGが濃くあとのGが薄くなったり、バンドの間隔が狭くなったりなど、特有のくせがあって、人の目と経験で判断しなければならないところがありました。 しかし、今のABIのシステムだと、ピークの高さが非常にそろっていますし、スペーシングもほぼ一定で（試薬や泳動システムの改良と、読み取りソフトによる補正が効いているのかも）、自動解析でもほとんどエラーはないです。 ベックマンは使ったことがないですが、ABIではピークはかなりそろっていて、特定の塩基がでこぼこしたり、それが精製のしかたで変わるということもないようです。

(無題) 削除/引用 No.1605-6 - 2008/07/23 (水) 10:42:40 - カナマイシン >A様 ありがとうございます。 なるほど、X→Yという流れにクセが生まれることがある、というのは CEQやってる身としても想像がつきます。 確かにサンプルによってはソフトウェアが判別をミスするくらい X→Y の流れに 問題が生じることがあるように思います。 とにかくABIにもクセはあるわけですね。 …使っている色素が違うのでしょうか？　それとも機械の関係？ そのへんは企業秘密なのですかね。 >名無し様 停止液の件は了解です。 Hi-Dye formamide ですか。よさそうな響きですね。 確かCEQのSLSは脱イオン化ホルムアミドそのものだった気がするので、 「Hi-Dye」と謳っているからには改良が加えてあるのではないでしょうか。 興味がありますのでこちらでも調べさせていただきます。 情報をありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1605-5 - 2008/07/23 (水) 09:23:52 - 名無し 変えて、というのは、新しく調製しなおして、 という意味です。紛らわしい表現をしてしまい申し訳有りません。 それでも駄目なら、ベックマン謹製のSLSの代わりに、 Hi-Dye formamideという溶剤を使ってみるのも手です。 Hi-Dye formamideはたぶんABIだとおもうのですが、確認してみます。 Hi-Dye formamideの方がSLSよりも安価でピークのたちがいい、 という評判です。

(無題) 削除/引用 No.1605-4 - 2008/07/22 (火) 21:19:09 - A 詳しく覚えていなくて申し訳ないのですが、ABIのシークエンサーで ある塩基Xの直後の塩基Yがいつもはっきり読めないと言う現象を 何度も見たことがあります。そのシークエンスが肝の場合はもう一度 ゲルを立てて読み直していました。ですから理由はわかりませんが 機器ごとに何らかの癖があるのは確かだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1605-3 - 2008/07/22 (火) 21:14:13 - カナマイシン >名無し様 同士がいらっしゃって安心しました。 やはりサンプルのキレイさが問題になるのですかね。 ちなみに「停止に使う液を変えて」というのはどのように変えられたのですか？ グリコーゲンを抜きましたか？　当方はマニュアル通り （酢酸ナトリウム、EDTA、グリコーゲン）から離れたことがありません。 そして、これはCEQ固有の問題なのでしょうかね？ それから「ベックマンが読めない」という噂というのは…文字通りの意味なのでしょうか？ こちらは差し支えあれば答えていただかなくて結構です（笑）。 単に使ってる人がやや少ないのかもしれないですよね。 私はCEQとBigDyeの両方を使ったことはないのでなんとも言えないですねー。 ただ、Webの情報やこのフォーラムあたりを見ていると、 「あっち（BigDye）はアプリケーションが多いんだなー」って思ったりもします。 しかしながらCEQに慣れてしまったのですこぶる快適です。 ぬりかべ時代は懐かしくもあり、苦い思い出でもあり。

(無題) 削除/引用 No.1605-2 - 2008/07/22 (火) 11:19:04 - 名無し 私のラボでもベックマンのCEQ8800を使用していて、 往々にしてアデニンのピークが異常を示すことがあります。 そんなときは、反応停止液に使う液を変えて、 70%EtOHのリンスと乾燥(バキュームドライなど)をしっかり行うと 改善することがあります。 そういえば、 ベックマンは「読めない」という噂をよく聞きますね。

キャピラリーシーケンサーにおける塩基ごとの『クセ』はある？ 削除/引用 No.1605-1 - 2008/07/22 (火) 10:22:38 - カナマイシン いつもお世話になっております。 当方、幾度となくDNAシーケンスを読んでおります。 最近はゲル板式（ぬりかべ）はほとんど使わず、 もっぱらキャピラリーシーケンサーでやってます。 ここで疑問なのですが、キャピラリー型だとある特定の塩基のみ不具合が生じることがあります。 私の場合、アデニンが往々にしてこれに当てはまります。 他の塩基はよく読めてるのに、Aだけ極端にピークが低かったり。 かと思えば偽ピークが頻発したり。泳動がAだけ若干早まったり。 察するにAに用いられているdyeの影響だと思うのですが… 具体的にどんな物質で、どういった夾雑物と吸収波長が重なりやすいか、など、 ご存じの方はいらっしゃいますか？　対策のためにもご教授いただければ幸いです。 ちなみにBeckmanのCEQ8000を使用しております。 マニュアル等には ・シーケンステンプレートの熱変性時間を長くしてニックが入りすぎると 　Aの偽ピークが出やすくなる。 ・酵素混合液がダメになるとAのピークが弱くなる。 といったことが書かれていまして、ここからもAのdyeがとりわけデリケートなんだな、と いうことが察せられるのですが…

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