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(無題) 削除/引用 No.1606-12 - 2008/07/22 (火) 18:54:03 - 名無し あぁ…pMalの方も脱リン酸しているのですね これは的外れなレスポンスをしてしまいました…

(無題) 削除/引用 No.1606-11 - 2008/07/22 (火) 16:38:50 - おお >[Re:8] Kanさんは書きました : > しつこいようですが、コントロールよりコロニー数が少ないのに、ミニプレップでチェックしてみたら当たりばっかりだったという経験が何度かあります。あれこれ迷っているより12クローン程度チェックしてみてはいかがですか。 わたしも意図的にそうなるように仕組むことがあります。大腸菌の発現ベクターですのでなおさらですね。とくにpMALで切り出したやつが確実にきれているのなら、拾って増やしてみればいいと思います。私が意図的に仕組んだ時は3ー4個シカ拾わないです。

(無題) 削除/引用 No.1606-10 - 2008/07/22 (火) 16:38:16 - りょう >[Re:8] Kanさんは書きました : > しつこいようですが、コントロールよりコロニー数が少ないのに、ミニプレップでチェックしてみたら当たりばっかりだったという経験が何度かあります。あれこれ迷っているより12クローン程度チェックしてみてはいかがですか。 僕もKanさんの意見に賛成です。 それが嫌なら手抜きせずvectorの方もゲル切り出しすれば良いのでは？

(無題) 削除/引用 No.1606-9 - 2008/07/22 (火) 16:32:40 - おお > pMALに載っていた構造遺伝子の変異をかけたい部位だけを取り出して、pHSGに載せ変えたため、元に戻した際に青白選択ができないのに加え、変異部位は制限酵素サイトとなっていないためカットチェックなどはできません。 > pMALの方を確実に制限酵素で切って、切れたものを使えば大丈夫です。あなたが今回挿入するインサートの長さと、ベクターの長さはどれくらいでしょうか。なるべく切れ損ないを持ち込まないために大きめのゲルで時間をかけて流すのもてです。

(無題) 削除/引用 No.1606-8 - 2008/07/22 (火) 16:30:13 - Kan しつこいようですが、コントロールよりコロニー数が少ないのに、ミニプレップでチェックしてみたら当たりばっかりだったという経験が何度かあります。あれこれ迷っているより12クローン程度チェックしてみてはいかがですか。

返信ありがとうございます。 削除/引用 No.1606-7 - 2008/07/22 (火) 16:09:59 - 苔 速い返信ありがとうございます。 pMALのみ切り出した後にライゲーションというのを既に試みてまして、先ほどコロニーを確認したところ、サンプルがコロニー数個に対しコントロールが十倍以上という結果になりました。 pMALに載っていた構造遺伝子の変異をかけたい部位だけを取り出して、pHSGに載せ変えたため、元に戻した際に青白選択ができないのに加え、変異部位は制限酵素サイトとなっていないためカットチェックなどはできません。 最終的にはシーケンスでチェックせねばならないのですが、はずれが多いとなると恐ろしく手間がかかりそうです。 色々アドバイスを頂いたので突き進むかちょっと考えてみます。 プレートももっと置いておいて、小さなコロニーが出てこないか見てみます。 ただ、一応グルコース添加培地なので、そこまで阻害されるとなるとその後の本培養も大変そうな気がします。

(無題) 削除/引用 No.1606-6 - 2008/07/22 (火) 15:03:31 - AP pMALを脱リン酸しているので、それのみをligationして出たコロニーは、切れ残りか、脱リン酸をのがれたもののはず。インサートとligationしたものがそれより少なくなるのはおかしいので、なにか別のファクターがあるのでは、と思います。 インサートが入ったものが、低レベルでタンパク質を発現してそれが大腸菌の増殖を阻害するために、コロニーが出ないとか、pMALとpHSGがつながると、二重のoriのせいかなんかで殖えないとか。もちろんpHSGにインサートがつながったものもできて、これがインサートの利用効率を下げていることもあるでしょう。 タンパク質が発現してしまうためにコロニーが出ないのなら、低温で培養するといいという。培地にグルコースを加えてlac promoterを抑制するのも効果があるかもしれません。pMALは確か、blue/white selectionができるはずですが、IPTGがインサートからのタンパク質発現を誘導してしまうので、やらないほうがいいでしょう。 pHSGの干渉を防ぐにはやはり切り出しをしたほうがいいのでは。

(無題) 削除/引用 No.1606-5 - 2008/07/22 (火) 14:45:39 - おお pMAL-c2はBamH1とEcoR1が隣接していますので、その後ろのSal, Xba, PstやHindなども使えるものがあれば使ってみてはとも思いますがどうでしょうか?pHSG298はほぼ同じような並びになってますし。

(無題) 削除/引用 No.1606-4 - 2008/07/22 (火) 14:34:40 - 名無し ベクターのみのトランスフォーメーションは、ライゲーション産物によるものよりも 十倍から百倍違うと言われています。 ポジコンとしてのベクターのみのトランスフォーメーション時のコロニーよりも、 ライゲーション産物由来のものの方が少ないのは、 むしろ自然なことのように思われます。 アルカリ-SDSなどのミニプレップや、コロニーPCRなどで確認してみることを お進めします。

(無題) 削除/引用 No.1606-3 - 2008/07/22 (火) 14:32:22 - おお たいていお示しになった方法は使えると思います。問題になるのはpMAL-c2の切れ具合と脱燐酸化でしょう。もし、EcoR1/BamH1の間に目的のインサートを切らない制限酵素サイトがあれば、ライゲイション中か後にその酵素で処理してやればセルフライゲーションのコロニーをへらすことができます(pMAL確認しましたけどなさそうですね)。pMAL-c2だけでもゲルから切り出して、しっかり脱燐酸化すればまず大丈夫だと思います。たしかにしっかりと両方切り出した方が心配ごとが減るのは確かですがUV照射の事をかんがえると余分なことしなくてもというきもします(UV照射については簡単に回避方法が取れますけどね)。 ライゲーションしないコントロールを取るともっとスッキリしますね。 >結果、コントロールの方にはそこそこコロニーが生えたのに対し、サンプル側はその10分の1程度だったため、当たりがほとんどないのではないかと考えコロニーをつつくのを保留しました。 直間的に入ってそうな気もします。DNA量とか、コンディションが分からないのでなんとも言いがたいのですが。あと、コントロールで何個コロニーが生えたかによってあきらめた方がいいかというのも判断基準になるかと、、、

(無題) 削除/引用 No.1606-2 - 2008/07/22 (火) 13:49:00 - Kan 求める環状分子の形成はインサートとベクターのモル比や濃度に依存するので、ベクターのみのコントロールよりコロニー数が少なかったからといって諦めるには早いと思います。ひとまず今出てきているコロニーをミニプレップでチェックしてみてはいかがですか。

Km耐性ベクターからAmp耐性ベクターへの載せ代え 削除/引用 No.1606-1 - 2008/07/22 (火) 13:28:03 - 苔 pHSG298のマルチクローニングサイトにのせていた構造遺伝子をEcoRI,BamHIで制限酵素処理して切り出し、pMAL-c2の同制限酵素サイトにライゲーションしました。 pHSGはカナマイシン耐性、pMAL-c2はアンピシリン耐性なので、ゲルからの切り出しはせず、pMAL-c2側にBap処理を施してからライゲーションを行い、アンピシリン入りLBプレートにまきました。 コントロールとして切り出し断片と混ぜていないpMAL-c2も同様のライゲーション処理を行い、同培地にまきした。 結果、コントロールの方にはそこそこコロニーが生えたのに対し、サンプル側はその10分の1程度だったため、当たりがほとんどないのではないかと考えコロニーをつつくのを保留しました。 おそらく切断断片がpHSGに戻る反応がpMAL-c2へのライゲーションを妨げたり、ワンカット、ノーカットのpMAL-c2が残っているのでしょうが、やはり両プラスミドに対してゲルからの切り出し処理を行った方が良いのでしょうか？ 同じようなセレクションの方法をとった経験のある方がおられれば教えていただきたいです。 長くなって申し訳ありません。

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