全19件 ( 1 〜 19 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1612-19 - 2008/07/24 (木) 20:27:48 - 海 皆様、お返事ありがとうございます。 > nickが入ってopen circular (nicked circular）になっているのでしょう。 > 通常、OCはlinearよりやや大きめにでますから（EtBr入りゲルですか？だとしたら差が大きめに出ているかも）。 > なんにせよ、XhoIサイトがつぶれている可能性が高いですね。 他の方もおっしゃってる用にXho�Tサイトがつぶれてるんですね。 説明不足でしたが、予想のバンド＋、その上に同じ量で（Xho�Tがつぶれていると思われることによる）バンドがでるので、ｹﾞﾙ切り出しで除去してみます。 ところで、nicked circularってなんですか？すいません。 > primer dimerや制限酵素で切れた末端の切れ端などが除去されていないために、 > リンカーとなって想定外のligationが起こっているのかも。 制限酵素で切れた末端の切れ端も、可能性が高そうなので、 ｹﾞﾙ切り出しをして、もう一度やってみることにします。

(無題) 削除/引用 No.1612-18 - 2008/07/24 (木) 09:17:56 - 怠け者 プレートは乾燥してひび割れとかしていなければ大丈夫ですよ。ほかの人が書いているように心配なら抗生物質をまいてから使うといいです。 通常LBプレートはAmpを入れたのもばかり作っているので半年も経つ前に使い切ってしまってます。 それ以外はめったに使わないので抗生物質抜きプレートを必要最小限＋αくらい作ってます。乾燥を防ぐために1枚ずつシャーレにテープを巻いています。これは1年くらい経ってても使っています。使う前に抗生物質は入れるけど。 ボイリング法は昔やってました。律速段階は培養時間だと思います。PCRは数時間で終わりますからね。自慢すると昔は96個やったことがあります。数種類を一度にやったものですから、途中で自分が何をしているのか分からなくなりました。 本筋とずれてゴメン

改姓＆感想 削除/引用 No.1612-17 - 2008/07/24 (木) 09:05:35 - りょうた りょうさん、失礼しました。 名前変えます。 プラスミド抽出のプロトコールですが、１０数年前の実験ノート探したら、upします。 こちらの書き込みなさっている方々の背景がわからないので、プラスミド抽出ごときでの反響が大きさに驚きました。 と同時に、今研究室でやっている実験が特定できそうな質問には、ボスの困惑している顔が目に浮かびました。 論文一番乗りや特許取得で不利にならないようなフォーラム利用を期待致します。 以上、感想でした。 ※　恐れ入りますが、このメーセージへの批判や反論はご遠慮申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1612-16 - 2008/07/24 (木) 08:28:54 - AP >50ってすごいおおいですね。 私も、インサートが一種類の普通のサブクローニングでは、6とか12くらいしか拾いませんね。前にも書き込んだと思いますが、それくらい拾えば当たりは取れるし、Alkali/SDS（PCI抽出、kit使用なし）で取ってもたいした手間ではないので、多数のコロニーからプラスミドを取ったりコロニーPCRをやったりの予備スクリーニングはしません。当たりのプラスミドのみ、必要に応じてあとからPCI抽出やkit精製をしています。 ラムダファージクローンやBACクローンなどの制限酵素消化物に含まれる多種類のフラグメントをそのままサブクローニングする場合や、ExoIIIでsequential deletionをとるときは別で、場合によっては100コロニーくらい一気にスクリーニングします。そういうときにboiling methodを利用しています。

(無題) 削除/引用 No.1612-15 - 2008/07/24 (木) 07:45:42 - AP >また、今日、enzymeを単独で反応させて電気泳動したら、Xho�Tでvectorよりも1000-1500bp上にバンドがでました。 nickが入ってopen circular (nicked circular）になっているのでしょう。 通常、OCはlinearよりやや大きめにでますから（EtBr入りゲルですか？だとしたら差が大きめに出ているかも）。 なんにせよ、XhoIサイトがつぶれている可能性が高いですね。 >プラスミドは上記2つでdouble　digestionこちらも一部電気泳動し、閉環状と比較して切れていることを確認する もとのプラスミドをXhoIだけで切ったらちゃんと切れますか？ この段階ですでにつぶれているかも。でなければ、 >両方ともQIAGENのPCR　purificationキットか、ミリポア社のマイクロピュアEZとマイクロコンの組み合わせでenzymeと塩除去（今回は面倒でこちらでやってみた）。 primer dimerや制限酵素で切れた末端の切れ端などが除去されていないために、 リンカーとなって想定外のligationが起こっているのかも。 >> PS　それにしても、半年前のプレートを使用するとは、頭が下がります。 >やっぱりありえないですよねぇ。新しいの作ってもらいます。 古いプレートがもったいないとき、抗生物質抜きのプレートを転用するとき、 菌のスプレッドと同時に、抗生物質をたらしてスプレッドして使っています。

(無題) 削除/引用 No.1612-14 - 2008/07/24 (木) 06:33:35 - AP >横レスですがこのプロトコールをもう少し詳しく書いて頂けませんか。 横レスに横レスですが、これはboiling methodといって、Alkali lysisと同じくらい古くからある方法です。この業界であれば手近にMolecular Cloningが常備されていると思いますが、載っています。

(無題) 削除/引用 No.1612-13 - 2008/07/24 (木) 02:37:50 - おお >[Re:12] 海さんは書きました : > > また、今日、enzymeを単独で反応させて電気泳動したら、Xho�Tでvectorよりも1000-1500bp上にバンドがでました。 > star活性なら下にでると思うのですが、なぜ大きいものがでるのでしょうか？ > BamH�Tと閉環状のものにはそのようなバンドがでません。 > 最初NEBのでやって、？と思いtakaraのもあったので同様に反応させてみたのですが同様でした。気にしなくていいのでしょうか？ プラスミドのXho1サイトがないか、なにかの原因で潰れてしまってませんか?

(無題) 削除/引用 No.1612-12 - 2008/07/24 (木) 00:50:28 - 海 お返事ありがとうございました。 実は半年ぶりにクローニングをするので、忘れてるところ＆元々わかっていないところがあるのかも知れないので、私のやっている方法を述べてみます。 insert(550bp) primerにforwardはXho�T、reverseはBamH�Tをつけてデザインし、PCR 一部で電気泳動、extra　bandがないことを確認しておく。（extraがなければｹﾞﾙ切り出しはしない。） プラスミドは上記2つでdouble　digestionこちらも一部電気泳動し、閉環状と比較して切れていることを確認する。電気泳動してる間にブラントエンドなどではないけれども、念のためCIAPも１uL足して脱リン酸化しておく。（泳動の結果はすくなくとも１つはworkということになりますが、、、切れてでてくるものが数十bpでそちらは確認不可。） 両方ともQIAGENのPCR　purificationキットか、ミリポア社のマイクロピュアEZとマイクロコンの組み合わせでenzymeと塩除去（今回は面倒でこちらでやってみた）。ABSを測定し、モル比を　insert：vector＝10-30：１くらいにして、ligation（16度2時間） →transformation（DH5α）、plating。翌日、コロニーを拾って前培養へ。 といった次第です。 また、今日、enzymeを単独で反応させて電気泳動したら、Xho�Tでvectorよりも1000-1500bp上にバンドがでました。 star活性なら下にでると思うのですが、なぜ大きいものがでるのでしょうか？ BamH�Tと閉環状のものにはそのようなバンドがでません。 最初NEBのでやって、？と思いtakaraのもあったので同様に反応させてみたのですが同様でした。気にしなくていいのでしょうか？ > わたしも自慢させてください。たいていの場合コントロールを取りながら、系の働き具合をモニターして単純なサブクローニングであれば4個ぐらい拾って十分あたりがあります。ブラント、両側が同じ制限酵素であれば方向もありますので10個ぐらい拾いますかね。 去年ブラントエンドでやってた時も、上記の方法で16個拾えばあたらないことはそうそう無かったのですが・・・運が良かったのでしょうか・・・ > セルフが出現すると言うことは、強制クローニングではないということですね？ 強制クローニングってなんでしょうか？ > 私はPCR登場前のかなり古い人間ですが、アルフォス（BAP)処理不完全だったということでしょうか。 私の情報が不十分なためのコメントですが、たぶん、それはないと思います。 > 私は１．５時間もあれば５０個ぐらいでしたら、ミニプレップから制限酵素処理・電気泳動までやってました。 早い！！！、35個で4時間結果までにかかります。 同じ方法検討してみます。 コロニーPCRは便利そうだなと思いつつ、なぜか、なんだか手が出ません。 たぶん周りで誰もしたことが無いから。 > PS　それにしても、半年前のプレートを使用するとは、頭が下がります。 やっぱりありえないですよねぇ。新しいの作ってもらいます。

(無題) 削除/引用 No.1612-11 - 2008/07/24 (木) 00:47:48 - 初心者 > 方法は、中村祐輔先生のラボマニュアル実験書の煮沸法（溶菌・ボイル（1分）・遠心（15分）・菌残骸の除去（つまようじ）・エタチン・制限酵素処理（30分）・泳動（10分）でしたら、この程度はできます。 > > > 律速は、遠心機を何台独占できるかです（笑）。 横レスですがこのプロトコールをもう少し詳しく書いて頂けませんか。 既に公開されているのであれば論文なりWebのLinkなどを示して 頂けると助かります。

(無題) 削除/引用 No.1612-10 - 2008/07/23 (水) 21:52:01 - おお >[Re:8] りょうさんは書きました : > 私は１．５時間もあれば５０個ぐらいでしたら、ミニプレップから制限酵素処理・電気泳動までやってました。 わたしも自慢させてください。たいていの場合コントロールを取りながら、系の働き具合をモニターして単純なサブクローニングであれば4個ぐらい拾って十分あたりがあります。ブラント、両側が同じ制限酵素であれば方向もありますので10個ぐらい拾いますかね。 50ってすごいおおいですね。パーシャルとかで複数のプラスミドの存在が考えられて、しかもインサートの方向が定まらないようなばあいはどうされているんでしょう。

トピとは無関係ですが・・・ 削除/引用 No.1612-9 - 2008/07/23 (水) 18:05:26 - りょう 「りょう」というハンネを使用している人が２人います。 可能なら２人目の方、変更願えますか？

(無題) 削除/引用 No.1612-8 - 2008/07/23 (水) 18:05:23 - りょう セルフが出現すると言うことは、強制クローニングではないということですね？ 私はPCR登場前のかなり古い人間ですが、アルフォス（BAP)処理不完全だったということでしょうか。 私は１．５時間もあれば５０個ぐらいでしたら、ミニプレップから制限酵素処理・電気泳動までやってました。 皆さんのようにPCRは、使ってませんでしたが、迅速に結果を得ていました。 試薬の価格も安いですしね。 方法は、中村祐輔先生のラボマニュアル実験書の煮沸法（溶菌・ボイル（1分）・遠心（15分）・菌残骸の除去（つまようじ）・エタチン・制限酵素処理（30分）・泳動（10分）でしたら、この程度はできます。 律速は、遠心機を何台独占できるかです（笑）。

(無題) 削除/引用 No.1612-7 - 2008/07/23 (水) 17:49:06 - りょう プレート使用前に、抗生物質入りの培地を少々（10cmシャーレで1ml)すわせておく。ベンチ内でプレート表面を乾燥させてから、まく。 以上、手抜き実験プロトコールでした。 PS　それにしても、半年前のプレートを使用するとは、頭が下がります。

(無題) 削除/引用 No.1612-6 - 2008/07/23 (水) 16:43:39 - 海 たくさんの御返事ありがとうございました。 > 10000と8500？bpは、ゲノムDNAでプラスミドが入っていなかった？　抗生物質の効きはok? そうなんです、とてもプラスミドが入ってるとはおもえないレーンがたくさんあって・・・。 抗生物質入りのプレートって皆さんどれくらいの期限をもうけてますか？ うちは、半年でも平気でつかってて、本には２−３週と書いてあるのは知ってるのですが、他の人もそれでやってるのでなかなか自分だけ新しいプレートを作ってと助手さんにいいにくい・・・。＆前培養のLB培地+抗生剤（Aｍｐ　or　KM）でもちゃんと増殖してきたので、セレクションされてはいるなと思ってるのですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.1612-5 - 2008/07/23 (水) 09:24:40 - AP >制限酵素処理後、セルフの4300ｂｐか、2500？と4300ｂｐ、もしくは10000と8500？bpばかりでました 2500？と4300ｂｐも自己環状化したものでしょうね。2500 bpはおそらくcccで制限酵素処理が不十分で切れ残ったか、アルカリ処理の過剰で変性してしまって、切れなくなっている分子でしょう。 10000と8500？bpは、ゲノムDNAでプラスミドが入っていなかった？　抗生物質の効きはok? 結局、35クローンのうちひとつも当たりがなかったということになりますが、 やはり、transformation以前のステップの問題でしょう。

(無題) 削除/引用 No.1612-4 - 2008/07/23 (水) 08:56:20 - in situ 35個の内訳がどうなっているのか（全部同じクローンなのか、違うクローンなのか）わかりませんが、自分だったら、Mini Prepに持って行く前にコロニーPCRなりで確認すると思います。 そうした方がMini prep後に今回のように問題が生じたときに解決しやすいです。 今回は4300とか8500とか、セルフライゲーションしたようなものが多く取れているようなので、コロニーPCRでセレクションしていれば、Mini Prepするサンプルが少なくて済むはずです。

(無題) 削除/引用 No.1612-3 - 2008/07/23 (水) 08:29:48 - 海 お返事ありがとうございました。 やっぱりそうですか・・・ まずは、制限酵素がworkしているかからみてみます。

(無題) 削除/引用 No.1612-2 - 2008/07/23 (水) 01:44:42 - おお >[Re:1] 海さんは書きました : > 植え、翌日朝用事があったので、4時間ほど4度冷蔵庫で保存しました。 > 4度で保管などするとE.coliひいてはプラスミドが傷んだりすることなど > あるのでしょうか。 4度で保管が原因ではないと思います。もう一度冷静にそれ以外の原因を考えてみてください。 ライゲーションなどの過程がうまくいってないとか、、、チェックの時の酵素処理がうまくいってないとか、、、

ミニプレップ 削除/引用 No.1612-1 - 2008/07/23 (水) 00:25:51 - 海 どうか教えてください。 transuformationしたDL5αのコロニーを（insert550kb、plasmid4300kb） ミニプレップ用に前日に2ccの培地が入ったスピッツに 植え、翌日朝用事があったので、4時間ほど4度冷蔵庫で保存しました。 結果、35個全滅でした。（制限酵素処理後、セルフの4300ｂｐか、2500？と4300ｂｐ、もしくは10000と8500？bpばかりでました） あんまりこんな数全滅したことがなかったのですが、 4度で保管などするとE.coliひいてはプラスミドが傷んだりすることなど あるのでしょうか。 もしくは、それ以前の問題でしょうか。

全19件 ( 1 〜 19 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---