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(無題) 削除/引用 No.1615-12 - 2008/07/29 (火) 00:43:42 - DNA 皆様 色々な御意見を頂きまして、誠に有難うございました。 また返事が遅れてしまい申し訳ございませんでした。 ひとまずは両方のDNAを用意し、並行して実験を行うことになりました。 本当に有難うございました。 ひとまず「済」とさせて頂きますが、 何か他に御意見御指摘等ございましたら、今後とも宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1615-11 - 2008/07/25 (金) 15:23:57 - Caspase 私はヒトのモデルでヒトの遺伝子を扱う、マウスのモデルではマウスの遺伝子を扱うのは当たり前と認識しています。 そもそもそれぞれをクローニングすることがそんなに手間のようにも思えませんし... (DNAさんのケースだと私ならご指摘の様に同じプライマーでtemplateを変えてクローニングしておきます。primerが使えなければ作りなすおすか、或いは3AAの変異程度なら片方をクローニングしてmutagenesisでもう一方のものを作ります。) また、一つの論文でマウスとヒトそれぞれを同じように解析する必要があるかという点では、これは必ずしも必要ではないと思います。一貫してヒトあるいはマウスでまとめていいと思います。 ただし、研究の長期的な流れとしてヒトからマウスまで解析を行うことを前提としている場合は早いうちに比較実験をした方がいいでしょうね。しばしばヒトとマウスで機能が異なることがありますから。 例えば、免疫系で働くヒトのある遺伝子Xが、多くのマウスのストレインが保持しているXでは点変異が入っていて機能不全になっており(このXの場合はいくつかのストレインでは機能的)、その結果としてあるウイルス感染のヒトとマウスでの応答性がまったく異なるというケースもあります。 マウスとヒトそれぞれを解析しておくことは倫理的な側面もあるかもしれませんが、それよりも研究が途中で頓挫してしまう可能性を早いうちに見極めておくという意味でヒトからマウスまでの解析を想定している場合は非常に重要だと思います。ただし全部一から平行してやるのではなくて、どちらか一方で解析し、面白い機能が見出されればもう一方で確認するというのが効率が良いと思います。 ヒトとマウスで機能が違ったとしてもやりようはあるかと思いますが...そこは頭の使いどころですね。

(無題) 削除/引用 No.1615-10 - 2008/07/25 (金) 11:21:57 - 駄馬 さらに追加です。 例えばたまたま手許にあった最新号のCellには、Circadian Clockに関する２報の論文が出ていますが、いずれの論文でも特に種特異性にこだわることなくヒト由来のcDNAをマウスの細胞で解析しています。 これに限らず、私が良く読む細胞内シグナル伝達やメンブレントラフィックなどの論文（理学部系？）でも、ヒト、マウス、ラット、昔から解析されているタンパク質の場合ならウシなどのcDNAが入り乱れて使われています。もちろんそれが望ましいとは思いませんが、目的とのバランスなのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1615-9 - 2008/07/25 (金) 10:56:37 - 駄馬 誤解があるようなので追加します。 論文のmaterials and methodsは、その実験を再現できるように書くべきものなので、全ての実験材料はその由来を明らかにするのは当然です。従って、「断わりなしで」別種のcDNAを用いた実験の結果を、そのことを明らかにせずに論文に含めるようなことはあり得ません。 入手しやすい云々というのは、既に種々の変異型やタグ付加型等が完備しているような状況の話です。 もちろん、研究室で主に使っている細胞が293で、元々がヒトの遺伝疾患に由来する研究であって、先行研究で種々の研究試料がマウスのcDNAを元に完備されていると言うような事情が無いというのであれば、マウスのcDNAを「わざわざ」使う理由はありません。

(無題) 削除/引用 No.1615-8 - 2008/07/25 (金) 08:50:04 - しちみ >> でも、それ以外のほとんどの実験は、入手し易いcDNAを使って行われているというのが実情ではないでしょうか。 >実際、少ない経験ですが、私の周りもそのような傾向があるように感じます。勿論、マテメソに明記する事が多いと思いますし、そのDNA、材料で得られた結果として、その結果自体は本物なのでしょうが、言葉は悪いですが、ほんの少し気持ち悪さ、というか違和感？を感じる事があります。ただ現状はお二人が仰っているように手間を省くため、また同一の機能が予測されるために一種類で行っているんでしょうね。 一連の記事に、ちょっと違和感を感じています。 住んでる業界によって違うんじゃないでしょうか？ 医学系のジャーナルで断わりなしで結果を出したら、ヒトの遺伝子だと読者は推測しますよね？ マウスの遺伝子を断りなしに使えば、インチキだと自分は思います。 モデル生物を扱う（理学部系の？）ジャーナル・業界では、遺伝子機能についての種の違いの関心は薄いかもしれません。それはモデル生物を扱っている前提として、ある程度は他の種にも演繹可能だと研究者自身が考えているからでしょう。 自分の経験では、ヒトとマウスでオルソログどうしを比較するヒトのほうがとGCリッチでPCRがかかりにくかったりして扱いにくい経験が多いです。 （個人的にはヒトとマウスに限って言えば、オープンバイオなどからの購入であれば入手性が違うとは感じませんが？） なので実際上はマウスの遺伝子で先行させて仕事を進めることもあると思いますが、ヒトの遺伝学や疾患に言及したいのならヒトの系でも確認しておくことは大切だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1615-7 - 2008/07/24 (木) 23:32:32 - DNA 駄馬さん、おおさん 有難うございます。 駄馬さん > でも、それ以外のほとんどの実験は、入手し易いcDNAを使って行われているというのが実情ではないでしょうか。 実際、少ない経験ですが、私の周りもそのような傾向があるように感じます。勿論、マテメソに明記する事が多いと思いますし、そのDNA、材料で得られた結果として、その結果自体は本物なのでしょうが、言葉は悪いですが、ほんの少し気持ち悪さ、というか違和感？を感じる事があります。ただ現状はお二人が仰っているように手間を省くため、また同一の機能が予測されるために一種類で行っているんでしょうね。 おおさん >ただ実験の最初から考える段階でそういう幅の広がりを考えて、計画する方がなにかと先で障害を回避しやすいかと思います。 幸い、新しいプロジェクトなのでおおさんが仰る通り、一から実験が計画できます。後で問題になるよりは先に手を打っておいたほうが良いですよね。運のいい事にこのタンパク質、ヒトとマウス間でスタート、逆にストップからしばらくはDNAレベルで同一なのでプライマーもワンセットでいいようで。 > 最近はサプリメンタルにデーターをつける場合が増えてきましたので、確認実験とかそういう所に載せる機会も多くなっているかと思います。 はい。この流れは個人的に非常に歓迎しています。

(無題) 削除/引用 No.1615-6 - 2008/07/23 (水) 21:33:30 - おお >[Re:5] 駄馬さんは書きました : > 結論が収束しつつあるようですが、そうなんですか？ > > 哺乳類のcDNAを扱う限り、その由来を気にして使い分けることの方がむしろまれではないでしょうか。もちろんRNAiのレスキューなどの実験のような例外はあると思います。また、抗原レセプターのような種特異性が予め想定できるような場合にはそれなりの配慮でしょう。でも、それ以外のほとんどの実験は、入手し易いcDNAを使って行われているというのが実情ではないでしょうか。 実情としてそうかといわれれば、そういう傾向にあると思います。私もあまり意識せず使っていたりすることも結構あります(昔にクローニングされたもので種間の違いが指摘されていないがきりは)。しかし、非常に昔にクローニングされたサイトカインでさえ(IL4とか)マウスと交差性がなかったりします。TNFは大抵細胞レベルでは反応しますが、タイプIIリセプターの親和せいは異種の物を使うと大きな差があります。 前にも少し触れましたが、昔ほど両者のcDNAを手に入れることは難しくなくなってきているので、目的の遺伝子産物の種間での違いを見ながら実験することは不可能でなくなってきているといえると思います。特に新規性のある、機能の分かってないものを扱うわけですから、初期の段階で種間の違いがあるかないか見極めがつくなら、研究の進み工合も早くなるのではとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1615-5 - 2008/07/23 (水) 16:08:10 - 駄馬 結論が収束しつつあるようですが、そうなんですか？ 哺乳類のcDNAを扱う限り、その由来を気にして使い分けることの方がむしろまれではないでしょうか。もちろんRNAiのレスキューなどの実験のような例外はあると思います。また、抗原レセプターのような種特異性が予め想定できるような場合にはそれなりの配慮でしょう。でも、それ以外のほとんどの実験は、入手し易いcDNAを使って行われているというのが実情ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1615-4 - 2008/07/23 (水) 14:51:39 - おお >[Re:3] DNAさんは書きました : > おおさん > > 確かにレスキューの実験では見かけますね。 > ただ、シンプルに培養細胞に強制発現（and/or KD）して〜〜と言う論文も多いかと思います。 KDの実験はoff targetの問題がありますから、siRNA2種類使ってどちらでもKDされ、その結果同じ結論がみいだせるという方法を取ることもできます。でもこれは2種類の効果のあるsiRNAを見つけないといけないという作業が加わります。ひとつうまくいって、2つめを使ったらKDがあまりされずまた設計してとかやってと言うことを考えると、配列がちょっと違ってsiRNAのターゲットにならないほかの生物のcDNAを使ってレスキューしたほうが早いのではという感覚だと思います。 勿論過剰発現やその他の実験から総合的にというアプローチでもいいと思いますし、私自身KDの実験を完ぺきにしてから次というふうには実験しないことの方が多いです。ただ実験の最初から考える段階でそういう幅の広がりを考えて、計画する方がなにかと先で障害を回避しやすいかと思います。 > こう言った論文の場合でも実はdata not shownだけれども過去になんらかの方法で両者に機能等の差異が無い事を確認しているのですかね？ している場合と、行当りばったりな場合があると思います。このトピの質問の内容の答えになるような過去の事例をさがすと、やはり私が主張するほどしっかりとした異種間の違いを念頭にした実験計画をせずにやっているものも多いと思います。というのも、クローニングが盛んだったころは、遺伝子を取ったというところから始まる場合が多かったからかもしれません。 現在マウスとヒトではゲノムの配列がわかり、昔のやってたようなクローニングもせずに物が得られ、さらに種間の違いも懸念として念頭に置きながらできる余裕がある時代ですし、そこをちょっと注意することで、たのラボに差をつけれるかもしれないなら、最初の計画の時にそういう足場を作っておいた方がいいかと思っている次第です。 > 個人的には確認実験であろうが、ネガティブデータであろうが公表してもらいたいものです。 最近はサプリメンタルにデーターをつける場合が増えてきましたので、確認実験とかそういう所に載せる機会も多くなっているかと思います。 実験の系がうまくいっていることが分かっている場合、自分の考えた結果が出なくても、真実を語っているわけですから、個人的にはネガティブという言葉を使ってほしくないと思ってますが、論文、発表を考えるとそうも行かなくなると言うのも現状として分かるような気がします。こういうのは当事者とコミュニケーションがとれれば、表面にでない情報も得られるようになるでしょうし、そういう意味で海外の研究者たちは仲良くコミュニケーションを取ろうとする人もおおいですね。 少なくとも、自分がやった実験に関しては、"ネガティブ ->廃棄" ではなく大切にした方がいいですし、そういうのが積もり積もっていいい研究ができる機会がふえるのではとも思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.1615-3 - 2008/07/23 (水) 06:59:56 - DNA おおさん 御指摘ありがとうございます。 >ヒト細胞でsiRNAでKDしておいて、cDNAの配列の違いを利用してマウスのcDNAの過剰発現でレスキューするというのが最近裏を取る実験としてよくやられるようになってきました。 確かにレスキューの実験では見かけますね。 ただ、シンプルに培養細胞に強制発現（and/or KD）して〜〜と言う論文も多いかと思います。 こう言った論文の場合でも実はdata not shownだけれども過去になんらかの方法で両者に機能等の差異が無い事を確認しているのですかね？ 個人的には確認実験であろうが、ネガティブデータであろうが公表してもらいたいものです。なんて思うのはこの業界に入ってまだまだ浅いからですかね。勿論手間が掛かりますし、そんな時間が有ったら他の実験やるよ、って話なんでしょうが。なんとかうまい事、、、すいません話が脱線しました。 > 両方を得て両方で裏を取りながら実験していくのがいいかと思います。 やはり心配する位なら、最初から両方を扱った方がよいですね。 この答えを期待？しつつ、でもやっぱり、、、なんて甘えていました。 頑張ります。

(無題) 削除/引用 No.1615-2 - 2008/07/23 (水) 05:07:03 - おお >[Re:1] DNAさんは書きました : > ヒト型、マウス型両方を平行して使っている論文もあまり見かけませんし。 あるとおもいます。ヒト細胞でsiRNAでKDしておいて、cDNAの配列の違いを利用してマウスのcDNAの過剰発現でレスキューするというのが最近裏を取る実験としてよくやられるようになってきました。 最近ではヒトまうすで可也保存されていても違う機能があるとかいうのも見かけますし、ヒト疾患にかかわる遺伝子のオーソログをトランスジェニックでいじっても症状が見られないなどというものもありますから、300中3アミノ酸という、非常に保存されていて、楽観的に考えてもよさそうですが、両方を得て両方で裏を取りながら実験していくのがいいかと思います。再現性という意味でも2つもっておくと説得力がありますし、違う結果が出たならそのことに関しては実験デザインで今後注意していけばいいと思いますし。

cDNAの選択（ヒト型？マウス型？） 削除/引用 No.1615-1 - 2008/07/23 (水) 04:00:22 - DNA いつも勉強させて頂いております。 私はあるヒトの疾患をテーマとし、マウスやヒト由来の材料を使って研究しています。この度、ヒトの疾患に関わる（かもしれない）、ある膜輸送タンパク質の機能解析を行うことになりました（あまり機能がわかっていないタンパク質です）。 そこで市販のcDNAを購入し、新たに一からコンストラクト（まずは発現ベクターから）の作製を始めようと考えているのですが、ここでふと疑問に思いました。 皆様は目的のタンパク質の発現ベクターの構築の際、どのような基準でヒト型、またはマウス型（またはその他）のアミノ酸配列（cDNAというべきか）を選んでいるのでしょうか？ これまで私が扱った発現ベクターは、アミノ酸レベルでヒト、マウスが100％マッチのもの、または元々ラボにあったもの、頂きもの、等であまり深く考えずに使っておりました。 しかし実際今回のタンパク質はおよそ300aa中、ヒトとマウスで3aaの違いが有り、さてどうしたものか、となった次第です。 一アミノ酸置換によってタンパク質の局在、機能が大きく変わる可能性がある事を考慮に入れると無視できない問題だと思うのですが、かと言って同一のタンパク質の発現ベクターに対し、ヒト型、マウス型両方を平行して使っている論文もあまり見かけませんし。 今後は、オーソドックスかつ曖昧ではありますが、幾つかの培養細胞（ヒト、マウス由来双方）、マウス初代培養細胞、変異マウス、場合によってはヒトの疾患サンプルを材料とし、強制発現、RNAiなどを併用し、生化学、細胞生物学、組織化学的にアプローチしようと考えております。 私の場合、最終的にヒトの疾患に結果を還元する事を考慮に入れれば、ヒト型を使った方が良い気もするのですが、例えばRNAiによるKDをマウス初代培養細胞を用いて行うとするとその対象はマウスな訳で、、、それともあまり気にせず思いついた方を使ってしまうものなのでしょうか？ 一般論、皆様の経験論含めて様々な御意見、御指摘を頂けると幸いです。 また一通り過去のトピックは検索したつもりなのですが、 もし重複しているようであれば御指摘下さい。 宜しくお願い致します。

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