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(無題) 削除/引用 No.1617-5 - 2008/07/24 (木) 03:48:48 - おお >[Re:4] ともさんは書きました : > お返事ありがとうございます。 > このタンパクは核酸に非特異的に結合することがわかっていますので、tRNAとかではspecificも消えるような気がします。 RNA結合タンパクってコンセンサスが存在していても幾らかでも配列非依存的なアフィニテーがあって、なかなか難しいですよね。 まいかいそういう意味でどうしようかと悩むことがあるのですが、tRNAがだめならなんかDNAを入れてみようかとか、、例えばオリゴdTとかランダムヘキサマーとか、サーモンスパームDNAとか助けになるかなと思ったりもします。 ヘパリンは強くネガティブにチャージしていて、タンパクなどのポジティブの電荷をカバーし非特異な電荷による核酸の相互作用をブロックします。 スペルミジンはポジティブの電荷のため核酸の負電荷を中和し、電荷による非特異な相互作用を抑えます。 おもちのリコンビナントがRNA結合たんぱく質であるなら、精製した状態でも、すでにRNAを抱え込んでいる可能性があると思いますので、そういった時はRNAの持たないリコンビナントよりは効率が落ちる可能性がありますね。この辺は見えるようで見えないところなので難しいと思いますが。わたしなら高い塩濃度で一度洗ってみるかなぁ、、、 グリセロールは疎水的な相互作用を幾らか吸収してくれるのでノンスペが落ちるそうですね。同じような意味でスクロースとかを使うこともあるようです。 > ゲルシフトができたらうれしいですが、RI使えないので、今のところできません。 ゲルシフトはNON RIの方法がじゅりつされています。ピアスあたりがキット化してますがようするにDIGでラベル入れてAPで検出と言う物だったと思います。RNAのばあいラベルの仕方を幾らか考慮しないといけないと思いますが、工夫すれば使えると思います。私はRIでやってますが、、、

(無題) 削除/引用 No.1617-4 - 2008/07/23 (水) 19:28:46 - とも お返事ありがとうございます。 このタンパクは核酸に非特異的に結合することがわかっていますので、tRNAとかではspecificも消えるような気がします。 しかしグリセロールはやってみたいと思います。昔、IPでグリセロール入れてノンスペ消すっていう方法思い出しました。 ゲルシフトができたらうれしいですが、RI使えないので、今のところできません。 いろいろご指導ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1617-3 - 2008/07/23 (水) 12:29:06 - おお あ、グリセロールを10%ほど加えることもあります。

(無題) 削除/引用 No.1617-2 - 2008/07/23 (水) 12:09:14 - おお タンパクをぷるダウンしてRNAを見るというのはあまりやらないのですが、ゲルシフト、UVクロスリンクなどでタンパクとRNAの結合を見たりはよくします。 大抵の条件は 10mM HEPES pH8 100mM(以上) NaCl or KCl 1-5mM MgCl2、MgSO4 or Mg(CH3COO)2 (1mM DTT) たんぱくによっては NP-40などのなどの界面活性剤を0.1%くらいいれます。 ノンスペを減らすために酵母などのtRNA0.1-1ug/ulを加えたり 1ug/ulクラいのヘパリンを加えることがあります。 ランダムな配列のライブラリーからスペシフィックなコンセンサスを見つけるためにセレックスというほうほうがありますが、この場合は、お示しのようなプルダウンをなんどか行って濃縮するのですが、ノンスペを減らすために500mMー1Mの塩(NaCl)を使うこともあります。

RNAとタンパクの結合 削除/引用 No.1617-1 - 2008/07/23 (水) 10:15:18 - とも 今in vitroで転写させたRNAと大腸菌で作ったリコンビナントタンパクの結合を見ています。 方法は GSTタンパクとRNAを混ぜて、GSTカラムでpull-downしてRNAを精製してRNAを定量しています。 結果タンパクを入れたものと入れないものでRNAのコピー数がほぼ一緒になってしまい、特異的な結合が全く見れません。 やったことある人に教えてほしいのですが、反応させるときのbufferとwash bufferの組成ってどんなものをしようしていましたか？

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