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(無題) 削除/引用 No.1621-13 - 2008/07/24 (木) 22:20:10 - Yeast hybrid systems 弘法さん 本当にありがとうございます． その通りに実験するようにします．

(無題) 削除/引用 No.1621-12 - 2008/07/24 (木) 20:35:51 - 弘法 入れ違いになってしまいました。 No.1621-10でお書きになっているのは私が言いたいこととは違います。Hisの選択をくぐるような形質転換体が空ベクターの時に出るかどうかを常にチェックし、擬陽性が多い回の実験は無効と見なすということです。

(無題) 削除/引用 No.1621-11 - 2008/07/24 (木) 20:33:17 - 弘法 ごちゃごちゃ書いて分かりにくくなってしまいましたが、私からの助言は次のとおりです。 ・プレカルチャーは、常にグリセロールストックからフレッシュに起こし直したシングルコロニーから出発する。 ・ライブラリーの形質転換と平行して、同じ量の空ベクターを用いた形質転換を行い、それぞれを-His培地にまき出す。「His+の形質転換体数」／「総形質転換体数」の割合が両者で差がない場合には、生えてきたものは擬陽性の可能性が高いので、その回の実験は失敗とみなし形質転換からやり直す。 ・上記比率が「ライブラリーの形質転換」＞「空ベクターの形質転換」ならば有望なので実験を先に進める。

(無題) 削除/引用 No.1621-10 - 2008/07/24 (木) 20:27:54 - Yeast hybrid systems 弘法さん どうもありがとうございます． では，初めにX-gal（His＋）でセレクトして， その後のコロニーを３−AT（His-）でセレクトすることにします．

(無題) 削除/引用 No.1621-9 - 2008/07/24 (木) 20:23:27 - 弘法 変異でしょうね。 擬陽性にもいろいろなケースがあり得ますが、お話の場合のように最初にHisの選択を掛けて生えてきたものの内には、例えばDNA結合ドメイン融合タンパク質を発現するプラスミドに変異が生じて、これ自身で転写活性化能を持つようになった擬陽性が含まれています。こいつはもちろん同時にlacZも発現させることができます。 これは先に「β-gal活性を見る場合の培地はHisを抜いておくと、陽性の場合に発色が良くなることが期待できます。」というのとは別の話です。

(無題) 削除/引用 No.1621-8 - 2008/07/24 (木) 20:07:31 - Yeast hybrid systems 形質転換は同じカルチャーから行っています． 実は空ベクターの時にもHis-培地（０ｍM　３−AT ）で少しポジティブが出ます．その出てきたコロニーをX-gal培地（His+）にまくと，青くなってしまいます． しかし，ベクターを導入した酵母を最初にHis＋のX-gal培地にまいても青くなりません．これはやはり変異によるものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1621-7 - 2008/07/24 (木) 19:23:43 - 弘法 ライブラリーの形質転換と空ベクターの形質転換は、同じ時に同じカルチャーから出発して行っていますか。それで前者が1/100がHis+、後者が全くHis+が出ないという状況だということでしょうか。そうではないという前提で以下を続けます。 変異の頻度が1/100というのはあまりに高すぎますね。プレカルチャーの初期に変異が生じてそれが蓄積したということかも知れません。例え培地にHisが含まれていたとしても、His+の株の方がHis-の株より生育が良いでしょうから。これは、常にフレッシュなシングルコロニーから出発してプレカルチャーを準備することである程度回避できます。 また、空ベクターのみで全くHis+が出ないのであれば、それ以上3-ATの濃度を振る必要は（さしあたりは）無いと思います。 また、多くのthree-hybridの系ではプラスミドが2μmベースですので、選択を掛けるとコピー数が増えます（あるいは最適化されます）。そのため、β-gal活性を見る場合の培地はHisを抜いておくと、陽性の場合に発色が良くなることが期待できます。

(無題) 削除/引用 No.1621-6 - 2008/07/24 (木) 17:39:36 - Yeast hybrid systems 連続ですいません． 私の持っている系では，レポーター遺伝子はLacZとHis3です． β-gal活性を見る培地では，ヒスチジンは足しておかないといけないのですか？

(無題) 削除/引用 No.1621-5 - 2008/07/24 (木) 17:18:45 - Yeast hybrid systems 弘法さん アドバイスありがとうございます． 変異はどの程度の確率で起こるものなのでしょうか． 私が実験する限りでは，１万個の形質転換体のうち100個くらいが出てきます．そのすべてが空ベクターと確かめたわけではありませんが，少なくとも60個は空でした． そもそも，一般にはバックグラウンドを下げるために，レプリカ台を使って３-ATの濃度を振るものなのでしょうか．

(無題) 削除/引用 No.1621-4 - 2008/07/24 (木) 15:22:14 - 弘法 同じホストに同じプラスミドが入っているのに生えたり生えなかったりというのは何かがおかしいので、多数の形質転換体の内でホストかどれかのプラスミドかに変異が入ってレポーターが活性化されるようになったものだけが擬陽性として生えてきているのだと思われます。 空のベクターを直接形質転換した場合は、扱っているトータルの形質転換体数が少ないので、そのようなまれなイベントは引っかかってこないということではないでしょうか。

弘法さんへ 削除/引用 No.1621-3 - 2008/07/24 (木) 11:24:30 - Yeast+hybrid+systems ほとんどは完全な形をしています． しかし，２回ほど１塩基がなくなっていたことがあります． どちらもポジティブになっていました．

(無題) 削除/引用 No.1621-2 - 2008/07/23 (水) 18:59:47 - 弘法 状況がよくわからないのですが、スクリーニングで取れてきた空ベクターは、クローニングサイトが潰れていたりすることもなく、元通りの完全な形をしているのですか？

TwoまたはThree Hybrid法に詳しい方へ 削除/引用 No.1621-1 - 2008/07/23 (水) 16:32:11 - Yeast hybrid systems 私はYeast Three-hybrid法を行っています． 私の使っているシステムではレポーター遺伝子はHis3とLacZです． どのRNA配列と蛋白質が相互作用するかを知りたいため，RNAのDNA配列をライブラリーにしています． 調べたい蛋白質とRNAのライブラリーをクローニングし，酵母の株に形質転換した後，まず，-His培地（０ｍM　３-AT）にまいています． コロニーが出れば，X-gal培地や様々な濃度の３-AT培地にレプリカをとっています． ところが，RNAの配列の入っていない空のベクターばかりがポジティブとして出てきます． でも，蛋白質をクローニングしたベクターとRNA配列の入っていない空のベクターを形質転換してもポジティブは得られません． つまり，ライブラリーからスクリーニングした時のみ，空のベクターに対してポジティブが出てしまいます． この問題について何か知見を持っている方がいらっしゃいましたら，教えてください．

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