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(無題) 削除/引用 No.1624-8 - 2008/07/24 (木) 21:17:27 - yaman ＞おお様 おっしゃるとおり、試料も抗体を加えない状態で流してみます。 ありがとうございます！！

(無題) 削除/引用 No.1624-7 - 2008/07/24 (木) 16:38:20 - おお >[Re:6] yamanさんは書きました : > > ＞おお様 > おっしゃるとおり、オリゴマーを生理的な状態で検出するのはむつかしいかもしれません。抗体がくっついたまま泳動してウェスタンすることも考えたのですが、検出できるオリゴマーが何量体かが正確に知りたく、抗体を外す事を考えました。 抗体を加える前に試料(ライセートなどを)ネイティブゲルでながして、ウエスタンすれば複合体のサイズが分かるのではとおもったのですが、、、 これはゲル濾過が他の方から指摘されてますが、それにちかいとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1624-6 - 2008/07/24 (木) 16:15:49 - yaman みなさん、お返事ありがとうございます。 ＞名無し様 Gly-Hclの詳細な条件ありがとうございます。まずはその方法でしてみて、SDS-PAGEとどんな差がでるか見てみます。 ＞おお様 おっしゃるとおり、オリゴマーを生理的な状態で検出するのはむつかしいかもしれません。抗体がくっついたまま泳動してウェスタンすることも考えたのですが、検出できるオリゴマーが何量体かが正確に知りたく、抗体を外す事を考えました。 抗原でアフィニティをかけて精製するのはしたことがないのですが、pH2.5で外れない場合チャレンジしてみます。ありがとうございます。 ＞りょう様 おもしろそうな方法ですね。加熱するのもS-S結合を外す方法らしいのですが、DTTなんかでもできるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1624-5 - 2008/07/24 (木) 15:38:29 - 名無し アフィニティー精製した抗体を適当なカラム(GEのNHSやCNBrなど)に固相化するのも手です。 このカラムからの溶出物には抗体が含まれませんので、 抗体由来のノイズはなくなると考えられます。 精製に用いる抗原ですが、モノマーとオリゴマーの混合物ということなので、 ゲルろ過などで分離して精製に用いるのが一般的かと思われます。 また、こうして精製した抗体ならば、モノマーだけ、オリゴマーだけを検出できるので、 １枚のゲルに複数の同一サンプルを流して転写すれば、 転写の回数は１回で済むので、効率的だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1624-4 - 2008/07/24 (木) 15:26:06 - りょう 皆さんが懸念されているように難しそうですが、 他の方法としては、還元剤で抗体のS-S結合をはずしたり、パパインとかも使用できないですかね。 勿論、興味対象の複合体に作用しないとは言えませんが。

(無題) 削除/引用 No.1624-3 - 2008/07/24 (木) 15:20:02 - おお もう指摘がありますが、抗体-抗原の相互作用を切るということは、生体の最も強いタンパク相互作用の一つをはがすということですので、あなたのタンパクのコンプレックスが生理的な状態を保っていると限りません。プロトコール的にも気をつけないと、プロテインAからはがれた抗体は、１度あなたのタンパクコンプレックスから遊離するかもしれませんが、コンプレックスの解析の時また結合しじゃまをするかもしれません。 名無しさんのおっしゃるグリシンpH2.5も一般的なやり方ですが、抗体によってはpH1ぐらいまで下げないと出てこないものもありますし、そう言ったものはアルカリに振った方がいいこともあります。抗血清ということなのでそういう強い抗体が含まれる可能性がじゅうぶんあります。必要であれば抗原でアフィニティをかけグリシンpH2.5で外れるフラクションを取ってからスタートすると確実かと思われます。 目的サンプルなど分からないのですが、あなたの目的のタンパクにタグをいれるとかできればそちらのほうがいいかと思います。マルトース結合タンパクやそのた、抗体を介さずレジンにつくタグもありますし、FLAGであればanti FLAG M1抗体を使えば、この抗体であればカルシウム依存性なので、キレーター(EGTAなど)で抗体からたんぱく質を遊離できると思います。 ネイティブで電気エイどうしてから、ウエスタンでコンプレックスを解析するというのはあなたの実験では考えられないでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1624-2 - 2008/07/24 (木) 14:43:43 - 名無し 加熱処理はちょっとわかりませんが Gly-HClなら、0.1 M で、pH は 2.5 がいいと思います。 解離させたら、濃いめのTris-HClで中和しましょう。 他の方法としては、 3 M NaSCN や 4 M MgCl2(液は粘稠)で溶出する といった方法があります。 いずれの方法にしても、抗体からはがすという行為は、 タンパク質にとって過酷な条件を課することになるので、 タンパク質複合体の解離が予想されます。

免疫沈降後にnative pageしたいのですが 削除/引用 No.1624-1 - 2008/07/24 (木) 14:21:49 - yaman はじめまして。 現在、マウスに能動免疫してできた抗血清のassayをしております。 プロテインＡ、抗血清、免疫源（モノマー、オリゴマー含む）で免疫沈降後、native page、blue native pageをするのですが、オリゴマーを分解させずに抗体を外したいのです。 免疫に関する本をみますと、抗体を外すには加熱処理やグリシン塩酸塩を加えると書いていますが、具体的に加熱は何度何分でや、グリシン塩酸塩はどれくらいのpHで使用するかなどは詳細不明です。 知っている方がおられましたら、教えていただけませんか？

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