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(無題) 削除/引用 No.1628-8 - 2008/07/30 (水) 11:01:48 - Winter8 私は遠心で回収したことがあります。 50mLコーニングチューブにタンパク液とNi-NTAを入れて、 30分ぐらい攪拌し、3000〜5000rpmで15分遠心します。 その後、Washを2回ほど（これも3000〜5000rpmで15分遠心）、 溶出も同様です。 ただ、皆さんが書かれているように、収量は落ちます。 最近、使っている手法は、おおさんの書かれた >>溶出バッファーをくわえたご、径の太めのカラムにのせて、溶出液を得る です。Washの段階からカラムに乗せてます。 Bio-Radの10mlぐらいのカラムがよく使われていますが、 流速を稼ぐため、より径の太いカラムを使っています。 また、研究資金が潤沢にあるならば、 樹脂を軽く遠心して、浮遊している(=粒径の小さい)樹脂を除く というのも手かもしれません。 この手法は以前、この掲示板で出ていました。

(無題) 削除/引用 No.1628-7 - 2008/07/27 (日) 01:35:18 - おお カラムをそのまま使うのであれば、ペリスターポンプやカラムのにのっけるバッファーなどのリザーバーを高いところに置くなどして早さを稼ぐこともできます。これも支持体の圧力に対しても耐性を超えないことが前提です。レジンはメーカーにもよりますが、流速を稼ぐため、粗い物を用意していることもあるようです。

(無題) 削除/引用 No.1628-6 - 2008/07/27 (日) 01:28:50 - おお 支持体の強度にもよりますがバッチ吸着ご、遠心や静置にて上澄みをのぞき、何度か洗って、溶出用のバッファーをくわえて遠心して上澄みからサンプルを回収というのはよくある方法だと思います。カラムを遠心するよりこちらの方法の方がいいかとおもいます。アガロースは抗体をつけた状態でIPする時もほぼ同じ方法を取るわけですから、そのあたりの支持体強度にあわせて、回収方法をきめればいいかと思います。最後溶出バッファーをくわえたご、径の太めのカラムにのせて、溶出液を得ることもあります。乱暴な方法ですが粗精製ではよくある手段です。

(無題) 削除/引用 No.1628-5 - 2008/07/24 (木) 18:43:32 - DSC おそらくお手持ちのNi-NTA agaroseとは別物の話で恐縮ですが、、 GEのNi sepharose 6 Fast Flowを使っていますが、担体の粒径が大きいため、オープンカラムで精製しても「Fast Flow」の名のとおり流速が早く、ストレスがたまりません。 http://www.gelifesciences.co.jp/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=945 製品のページにバッチ法とオープンカラムを半々で混ぜた方法が紹介されています。この方法で精製すると非常に早いです。メーカーは「簡単15分精製！」と紹介しています。 http://www.gelifesciences.co.jp/catalog/pdf_attach/guide.pdf

(無題) 削除/引用 No.1628-4 - 2008/07/24 (木) 18:32:14 - kentalow Ni-NTAアガロースではないのですが、グルタチオンセファロースで BIO-RADのエコノカラムを15mlチューブに乗せて遠心して精製したことがあります。 イメージとしてはスピンカラムが大きくなったような感じです。

(無題) 削除/引用 No.1628-3 - 2008/07/24 (木) 17:46:12 - 名無し 遠心はしたことがないですね なんとなくNi-NTAアガロースにくっつかないイメージがあります。 できるのかもしれません。 別の方法としては、 抽出物なり粗生成物なりをエッペンチューブや15mlチューブに入れて、 適当な量のNi-NTAゲルを懸濁して、しばらく放置 遠心して上清を廃棄 ゲルを洗浄バッファーに懸濁 遠心して上清を廃棄 溶出バッファーに懸濁 遠心して上清を慎重に回収 SDS-PAGEなどで分析 の方が早いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1628-2 - 2008/07/24 (木) 17:42:45 - げる とりあえずIMACで精製できるかどうかの条件検討ならできます。ただし、荷重超過でゲルがつぶれてしまうので高回収率や、実験の再現性は期待できないでしょう。

オープンカラムでのNiアフィニティー精製 削除/引用 No.1628-1 - 2008/07/24 (木) 17:20:40 - ぴねる Niアフィニティー精製を手詰めのオープンカラムで行おうと思うのですが、 この時自然落下ではなく、遠心で落とすことはできないでしょうか。 精製に時間がかけられず、自然落下での時間を待つことができないのです。 現在Ni-NTA agaroseゲルが手元にあり、スピンカラム式のプレパックカラムを購入せずにできないだろうかと思いまして、質問しました。 よろしくお願いします。

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