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ESターゲティングのコロニーが少ないです トピック削除
No.1634-TOPIC - 2008/07/25 (金) 13:06:03 - ES
KOマウスを作製する為、targetingを行っていますが、コロニー数が非常に少なく困っています。

TT2 ES 10^7個に対してLacZ-PGK-Neo及びDT-Aを持つ20kb長のtargeting vectorを20ug electroporationしています。
条件は250mV、500uFで、time constantは10sec程度です。

その後、300ng/mlのG418でselectionをかけましたが、colony数が20個程度しか出てきません。

以前別のラボの系でtargetingした時は、200個ほど出てきていましたので困惑しています。

以前はtime constantが5.5sec程度、G418濃度が150ng/mlでしたが、これがそれ程criticalなのかもわかりません。

このように、colony数が異常に少ない場合、どのような原因が考えられますでしょうか？

よろしくお願いいたします。
　
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No.1634-7 - 2008/07/25 (金) 20:47:14 - onso9
私も条件設定をしたことがないのでどのパラメーターをいじればいいかはわからないです。ごめんなさい。。

ただ、エレポした細胞をキュベットから播種するときに、小さい塊がmedium中に浮いていると思うのですが、これはエレポによって細胞にできた小孔からDNAが出てきたもので、これが見えないとエレポ自体がうまくいっていないそうです。

ESさんの細胞でこのような現象が見えてなければエレポの条件を変える必要があるかもしれません。

答えにならずにすみません。。

(無題) 削除/引用
No.1634-6 - 2008/07/25 (金) 14:22:07 - ES
promoter trap法ではありません。

G418濃度はug/mlでした。すみませんでした。

確かにelectroporationの最適化が必要なようです。このような最適化を自分で行ったことはないのですが、どのパラメーターからいじっていくべきでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1634-5 - 2008/07/25 (金) 14:13:11 - onso9
promoter trap法ではないのですか？
もしそうでしたらうまくいっていると思いますが。。

他の方も指摘されているようにelectroporationの条件が最適化されてないのかもしれませんね。
ちなみに私は200V 950μF で行って、40mseqでした。

あとG418濃度はμg/mlではないですか？

(無題) 削除/引用
No.1634-4 - 2008/07/25 (金) 14:07:29 - ES
回答ありがとうございます。

当たりクローンは大体50個に1つくらいです。negative selectionが効いて数が減っているとは考えにくいと思っています。

確かに同じコンストラクトを使っているわけではなく、PGK-Neoも配列レベルで同じかどうかは分かりませんので、コンストラクト依存的な可能性もあります。

今からいくつか条件検討を行うつもりではいるのですが、ES細胞が貴重ということもあり、条件検討の優先順位をつけることができればと思っている次第です。

とりあえず、G418の濃度とvector濃度を検討しようとは思っていますが、何か見過ごしていないか心配です。

(無題) 削除/引用
No.1634-3 - 2008/07/25 (金) 13:31:25 - おお
ターゲッティングできたクローンは取れてませんか?
クローンが取れていればいいわけですよね。

(無題) 削除/引用
No.1634-2 - 2008/07/25 (金) 13:28:10 - ~
ES細胞にはエレクトロポレーションしたことはありませんが、
細胞、ベクター、ポレーションの機械と条件が変わっているのであれば、
同じ結果になることを期待していい理由が無いと思いますが…

>このように、colony数が異常に少ない場合、どのような原因が考えられますでしょうか？
条件検討不足が一番の原因だと思います。

>以前別のラボの系でtargetingした時は
同じコンストラクトを使っているわけではありませんよね。
それでは比較のしようが無いと思いますが。

>以前はtime constantが5.5sec程度、G418濃度が150ng/mlでしたが、これがそれ程criticalなのかもわかりません。

現在のラボのポレーションの条件はどのくらい最適化されているのですか？
条件次第で1桁くらいは変わると思います。
現在のラボに条件があるということは、条件検討されているのですよね。
その条件が作られたされた際のデータを一度見てみてはいかがでしょうか。

また、time constant とG418の濃度くらいなら、1回分過去の条件でポレーション、セレクションしてみればcriticalかどうかが分かるのではないでしょうか。

ESターゲティングのコロニーが少ないです 削除/引用
No.1634-1 - 2008/07/25 (金) 13:06:03 - ES
KOマウスを作製する為、targetingを行っていますが、コロニー数が非常に少なく困っています。

TT2 ES 10^7個に対してLacZ-PGK-Neo及びDT-Aを持つ20kb長のtargeting vectorを20ug electroporationしています。
条件は250mV、500uFで、time constantは10sec程度です。

その後、300ng/mlのG418でselectionをかけましたが、colony数が20個程度しか出てきません。

以前別のラボの系でtargetingした時は、200個ほど出てきていましたので困惑しています。

以前はtime constantが5.5sec程度、G418濃度が150ng/mlでしたが、これがそれ程criticalなのかもわかりません。

このように、colony数が異常に少ない場合、どのような原因が考えられますでしょうか？

よろしくお願いいたします。
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