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(無題) 削除/引用 No.1642-6 - 2008/07/27 (日) 11:22:22 - EcoRI 皆様、ありがとうございます 皆様のおっしゃる通り、実験の本筋から外れていて、生産的ではないことですね。 ただ、よくあること、ということがわかっただけでも、よかったと思います。 今回は本当にありがとうございました。 これで済みよさせて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.1642-5 - 2008/07/26 (土) 13:30:54 - おお 私もよくあることだと思ってます。しかし説明しろというとちょっとケースバイケースでしょうし、あれっとおもっても生産的でない事が結構あるので突詰めて考えないか調べないことの方がおおいです。 あとわたしも、つぶれているとすれば同一のクローンの重複を見ているのだろうと思いますが、ちゃんとアダプターがついているものが混じっていないのがちょっと不思議です。目的にもよりますが、シーケンスは切り出さなくても読めますし、シーケンスを決める必要があるならベクターからのプライマーを使って読んでいけばと思いますがどうでしょうか。 どうしても切り出して確かめてみたいのであればたしかBssH2がpBSだとMCSの両端についてたと思いますが、あとPvu2がそこから少し離れたところにあったかもしれません。一度マップを見てみるといいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1642-4 - 2008/07/26 (土) 12:44:33 - AP >皆様はそのようなことを体験されたことがありますでしょうか？ よくあることです。どうしてそうなるかという原因はひとつではないと思います。たとえば、 ・たまたま付着末端が削れてしまたものがくっついた（たとえば平滑末端同士で）。 ・そのcDNA分子の末端が、たまたま平滑化に失敗していて、リンカー/アダプターがつかなかった。その平滑でない末端が、たまたまベクターの付着末端とcompatibleだった。 シークエンスを調べれば推測はできるかもしれませんが、あまり生産的なことではないですね。 あくまでも、たまたま起こることなので、拾ったクローンが全部そうだとしたら、amplifyしたライブラリーであって同一のクローンが重複してとれたのか、教授様の記憶違いで、じつはEcoR1/Xho1でクローニングされているとかじゃないでしょうか。 EcoR1サイトの外側にもクローニングサイトがあるはずですので、EcoR1で入れたものだからといってEcoR1にこだわらず、ほかの酵素を使えばインサートのチェックやrecloningは可能だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1642-3 - 2008/07/26 (土) 12:28:14 - EcoRI 返信ありがとうございます。 もちろん、配列の解析は進めております。 らだ、制限酵素サイトがなくなる、というのが、私にはなかなか不思議な現象に思えたので、 他の方はどうなのだろう と思ったまでです。 >ただ、ノートや記録がなくてもシークエンシングしてみれば確認できるでしょう。 そうですね。 シーケンスすればすべてわかることですね。

(無題) 削除/引用 No.1642-2 - 2008/07/26 (土) 12:14:29 - ~ 大事なのは、サイトがつぶれた原因を探すことではなく、６個のクローンから必要な配列を取り出すことだと思いますが。 そちらは進めていますよね。 そのような経験はありませんが、メインの仕事を進める以外に余力があるのでしたら、 まずは、はじめのライブラリーから複数クローンと、得られたファージミドをシークエンシングして状況を確認してみてはいかがでしょうか。 前者でのみEcoRIサイトが２つあるのであれば、途中のステップで残っているサンプルを見ていけば分かるでしょうし。 はじめのライブラリーの時点でEcoRIサイトが１つであれば、ライブラリー作成時の記録を探していくしかないでしょう。 >アダプターは5'、3'とも Eco RI site が付加されているということなので この書き方からして、ライブラリーはラボで昔作ったものでしょうか。 そうであれば、アダプターについて、ノートか論文に記録されているのですか？ 教授がアダプターについて記憶違いしていて、無駄な時間を費やしていませんか？ ただ、ノートや記録がなくてもシークエンシングしてみれば確認できるでしょう。

pBluescriptのEco RI siteが潰れた？ 削除/引用 No.1642-1 - 2008/07/26 (土) 10:49:36 - EcoRI いつもお世話になっております。 現在、lambda ZAP cDNA ライブラリーから、DIG probでcDNAをクローニングしております。 １次、２次スクリーニング、in vivo Excisionを終了して、 とりあえずそれらしいファージミドを６クローン得ることができました。 教授によれば、ライブラリー構築キットの世代が古く、 アダプターは5'、3'とも Eco RI site が付加されているということなので、 インサートサイズを確認するために各ファージミド 100 ng を 10 U の Eco RI で２時間、37℃で消化しました。 1% TAEゲルで泳動したところ、Eco RIで切り出されるはずのインサートが出ず、リニアライズされたDNAが確認できるだけです。 教授に相談したところ、「どちらかのEco RI siteがつぶれたのだろう、よくあること」 とのことでしたが、 一体どの段階で潰れたのか、つぶれることがあるのかが疑問です。 皆様はそのようなことを体験されたことがありますでしょうか？ 例えば、現在のシステムで作ったファージミドを Eco RI, Xho I で切り出してもインサートが出ない、といった現象です。 長々と書いてしまいましたが、よろしくお願いします。

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