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みなさまありがとうございます 削除/引用 No.1649-5 - 2008/07/29 (火) 17:52:43 - emsa 御返事遅れましてすみません。 いろいろなアドバイスありがとうございます。 みなさまの御意見を参考に少し工夫していきたいと思います。 ちなみに，プローブの長さは10bpに絞っているわけではなく，30bpにして行っています。 他にも忌憚なき御意見がありましたら，よろしくお願い致します。

目的蛋白質 削除/引用 No.1649-4 - 2008/07/28 (月) 11:09:15 - あべちゃん もし、標的DNAに対して結合する目的蛋白質がはっきりとしているのであれば、組換え体蛋白質を調製してそれを用いたEMSAをするのが良いと思います。 核抽出液を用いてバンドがはっきりとでないのは、標識したDNAに対して様々な蛋白質などが結合し、EMSAにおいて、DNAとの結合反応、ローディングバッファーを加えたとき、泳動中において、それらの様々な蛋白質がリリースするなどして生じた結果ではないでしょうか？ 組換え体蛋白質を調製するのに手間がかかるようでしたら、in vitro transcription/translationにて簡単に蛋白質を合成できるキットが各社から売られていると思いますので、それを用いれば簡単に確かめることができます。 　ただし、PIERCEのキットを用いている場合、HRPにて検出されると思いますが、in vitro translationキットの中にはreticulocyte lysateを用いており、その試薬中に含まれるhemoglobinが、邪魔をする場合があります。 　ですので、hemoglobinを含まないキットを用いるか、hemoglobinを除去（限外濾過など）するステップが必須となります。

(無題) 削除/引用 No.1649-3 - 2008/07/28 (月) 03:17:40 - おお コンペティターを入れているので、シーケンス依存的なバンドというのは確認されているのだと思います。プロモーターアッセイはしているようなので、てもとにある違う細胞を幾らか試し、活性の強い細胞をスクリーニングして、その細胞から核抽出を行うのも手かとおもいます。 核タンパク抽出は一般的な方法があるものの、個々のたんぱく質に最適化されている訳ではないので悩みどころですね。ターゲットのタンパクが抽出されているかという意味で、タンパクが分かっていない場合最適化は難しいですが界面活性剤を少し入れてみるか除くと言ったぐらいはできるかもしれません。あとは塩濃度のかげんくらいでしょうか。 私はRNAでコノテノアッセイをしたことがありますが、マグシウム依存せいと言う事がしばしあり、系からEDTAを除くことがあります。電気えいどうようのバッファーも同様に除きます(ただし私がやったのは、ライセートというより、精製したクリーンな物でしたのでライセートでどれだけノンスペを拾うかはよくわかりませんが)。 えいどう用バッファーはTGEとTBEがよく使われますが、これも今やっているもの以外でも試した方がいいかもしれません。ゲルの濃度が上げれるなら少し上げてみるとばんどがよりシャープになる可能性はあるとおもいます。T/Cも変えていいかもしれませんね。あとEMSAではあまりやらないのですが、電気えいどうそうのバッファーをゲルのバッファー濃度の半分にしてみると、薄い方が流れが早いため、若干のスタッキング効果が期待できるかもしれません。 ブロッキングにpoly(dI-dC)を使っているようですが、これが目的のタンパクに比較的強い親和性がある可能性をかんんがえて、オリゴdTやランダムオリゴマー、tRNAなど代わりに使って見るのもてかもしれません。 最後にプローブも工夫をすると改善するかもしれませんね。もう指摘があると思いますが、長めにするとか有効な場合もあり得ると思います。 経験と言うよりカンというところも多いのですが、お役に立つところがあるなら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1649-2 - 2008/07/27 (日) 21:33:31 - SP1 私も以前、同キットを使ってEMSAをやっていました。 それほどEMSAのスペシャリストではないのですが、フィルムの露光時間を長くするとか、ターゲットオリゴの濃度を上げてみるとかは試されているのですよね。 もしターゲットの10bp結合サイトが既知の転写因子であれば関連論文と同様の反応組成で試す価値はあると思います。 それから、確かPIERCE社のサイトに種々の塩及び界面活性化剤の条件でEMSAを試した結果のフィルムがあったと思いますのでそちらを参考にするのも良いかと思います。 また、ターゲットオリゴの鎖長を少し長く（10bpだったら両サイドに5bp〜程）することで解決した経験がありました。 ロジカルというより経験談ばかりで申し訳ありませんが、参考までに。

EMSAについて 削除/引用 No.1649-1 - 2008/07/27 (日) 15:59:01 - emsa いつも拝見させて頂いています。非常に勉強になりありがたく思っています。 ところで，今回は私の実験の件で御助言頂けないでしょうか。 現在EMSAを行っています。PIERCE社のnon-RIのキットを用い，核タンパク抽出はHepG2細胞からActive Motif社のタンパク抽出キットを用いて行っています。 とあるヒト由来のプロモーター領域を解析し，HepG2細胞を用いてもルシフェラーゼアッセイで約10bpの間にレポーター活性が大きく変化する領域を見いだしました。 この領域をプローブとしてEMSAを行っているのですが，はっきりとしたバンドが出ません（何となくぼやんとしたバンドは見えているように見えるのですが・・・）。 以前全く別の細胞株で同様の実験（全く別のプロモーターですが）を行ったときはうまくいったことがあり，その時と同様のプロトコールで行いましたが，今度はなかなかうまくいきません。 １．キットのbinding buffer，poly(dI-dC)，核タンパク，（＋ competitor）を混合後10分間氷上でincubate ２．3' 側にビオチンを付けたプローブを混ぜ，30分間 incubate ３．キットのloading bufferを混ぜ4℃で泳動する の手順で行っています（量は多少optimizeしていますが，基本的にはキットのプロトコール通りです）。 バンドがsharpに出ないとき次にどこをいじくるかを考えているのですが（タンパク量やプローブの量は上記のごとくある程度optimizeしています），解説書などを見ていると塩濃度やpHに影響される，KClの濃度で影響を受けるなどと書かれているものがあったり，また論文を拝見していると上記の氷上でのincubateを室温で行い，逆に室温でのincubateを氷上で行ったりしているものもありました。 とくにこのnon-RIのでのEMSAの経験を有しているみなさまにお伺いしたいのですが，プローブやタンパク量のoptimizeを行ったあとはどの辺りをoptimizeしていけばよいでしょうか。 御意見お待ちしております。

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