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(無題) 削除/引用 No.1664-19 - 2008/08/07 (木) 12:11:09 - Mi 個人的には、難しいwesternをするときはToYoBoのCanGetSignalとECLの 組み合わせが最強だと思っています。 あと、大抵の抗体は4℃、O/Nで反応させるのが一番良いと言われていると 思いますが、たまーに室温数時間の反応がベストな抗体もあるようです。 実際、CanGetSignal + 一次抗体を室温数時間で反応、でないとシグナルの 検出できない抗体を今使っています。

(無題) 削除/引用 No.1664-18 - 2008/08/05 (火) 10:32:49 - キョロ おお様、ありがとうございます。 4-クロロ-1-ナフトール法に比べて8〜10倍高感度が得られるという発色試薬を用いておりますが、他にも発色検出試薬がないかなど調べてみます。 いろいろとご助言ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1664-17 - 2008/08/02 (土) 00:17:47 - おお 化学発色試薬お使いの化学発色試薬については詳しくはないのですが、検出感度が初期のルミノール試薬から可也改善されたものが売られています。初期型のものか、改良されたものかで随分感度が違ってくると思います。お使いの試薬をチェックしてみるのもてかとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1664-16 - 2008/08/01 (金) 23:44:49 - キョロ おお様、ありがとうございます。 メールの件、検討致してみたいと思います。 mikan様、ありがとうございます。 >ゼラチン、血清、非たんぱくのブロッキング剤 非たんぱくのブロッキング剤は使ったことがないので、以前の書き込みを参考にして試してみようと思います。

私もここで教えていただきました 削除/引用 No.1664-15 - 2008/08/01 (金) 06:53:20 - mikan リン酸化のバンドがすごく薄くて、 何をしても先輩が何年やってもうまく行かなかったのですが、 ブロッキングにmilk類を使用しないことで、 解決しました。 ゼラチン、血清、非たんぱくのブロッキング剤 などを試してみられてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1664-14 - 2008/08/01 (金) 00:16:59 - おお >[Re:13] キョロさんは書きました : > > 今までに論文を書かれた先生に質問をするなどということを、恐れ多くてしたことがないのですが、論文にメールアドレスが載っておりましたので、メールしてもいいものなのでしょうか？ あなたが学生とかで、コレスポンディングオーサー(大抵教授とか)にメールするのであれば、あなたのラボのPI(ボス)にこんな感じでメールしたいという下書きをかいて、ボスに送ってもらってもいいかもしれません。あるいはあなたのボスにCCしておくればいいかとも思います。事情の説明などなるべく丁寧に書き、コレスポンディングオーサーは実験当事者でないことがおおいですから、ファーストオーサーに転送してもらえるかどうかとかなど文面に入れておくといいかもしれません。 コレスポンディングオーサーでなく、ファーストオーサーのメアドをラボのホームページなどから得て、メールするともうチョット楽かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1664-13 - 2008/07/31 (木) 20:25:43 - キョロ おお様、ありがとうございます。 >ライセートの調精の(抽出の)仕方とかでも変わってくるような気がします。 論文では、直接サンプルをSDSバッファーを使って潰すとあったので、プロテインインヒビターカクテルなど用いずに、直接潰して、即泳動しております。 やはり、この点で、何かしら論文に書かれていないような操作をしている可能性もあるということですね。 >発表された文献があり、その文献どうりでも出ないのなら、そのラボに一度問い合わせると細かい情報が得られるかもしれません。 今までに論文を書かれた先生に質問をするなどということを、恐れ多くてしたことがないのですが、論文にメールアドレスが載っておりましたので、メールしてもいいものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1664-12 - 2008/07/31 (木) 05:10:01 - おお MEK1 AntibodyでIPして、Phospho-MEK1 で検出というてもあるかなと思いましたが、、、 発表された文献があり、その文献どうりでも出ないのなら、そのラボに一度問い合わせると細かい情報が得られるかもしれません。 ライセートの調精の(抽出の)仕方とかでも変わってくるような気がします。

(無題) 削除/引用 No.1664-11 - 2008/07/30 (水) 15:53:06 - キョロ TS様、ありがとうございます。 >その配列についての情報はありませんか？ そのペプチドは合成ペプチドというだけで、それ以上の記載は説明書には載っておりません。 製造会社に問い合わせる場合、この配列にあう抗体はありますか？という質問には答えてくれるが、この抗体はどういう配列ですか？という質問には答えてくれないという話を以前聞きましたので、どういった配列なのかという問い合わせをしたことはございませんので、上記以上のことはわからない状態です。

(無題) 削除/引用 No.1664-10 - 2008/07/30 (水) 15:34:12 - TS ＜使用抗原・ヒトMEK1タンパク質・合成ペプチド、とのみ記載されております。 ならば、それは普通タンパクの全長でなく、ヒトMEK1タンパク質の配列を基にその一部を合成したペプチドを免疫の抗原にして作ったということです。 その配列についての情報はありませんか？

(無題) 削除/引用 No.1664-9 - 2008/07/30 (水) 15:22:38 - キョロ うんと様、ありがとうございます。 >蛋白量は十分ですか？ タンパク量は5μg〜60μgまで段階的に振って試してもみました。 PVDF膜に保持できる最大量までやってみたのですが、変わらずでした。 中年様・TS様、ありがとうございます。 この抗体はポリクローナル抗体で、MEK1 AntibodyはヒトMEK1の全長（説明書には使用抗原・ヒトMEK1タンパク質・合成ペプチド、とのみ記載されております）で、Phospho-MEK1 Antibodyはリン酸基結合セリン基の周辺領域を使用している物です。

MEK1 Antibodyの作成に使っている 削除/引用 No.1664-8 - 2008/07/30 (水) 15:01:01 - TS 購入されたMEK1 antibody がヒトのsample　をにんしきするかはかくにんされていますか？（抗体そのものがworkしない可能性） またMEK1 Antibodyの作成に使っているのは、ヒトMEK1の全長ですか？一部のエピトープのペプチドですか？ペプチドならその配列の鳥／昆虫での保存性はどうですか？

(無題) 削除/引用 No.1664-7 - 2008/07/30 (水) 14:41:22 - 中年 配列の一致は確認されているとのことで、この可能性は無いということですね。 それはそれとしてちょっと話がずれますが、このようなモノエピトープを認識する抗体の場合、アフィニティ精製したポリクロだと、ピッタリの配列はどのロットでもきちんと認識できる（はず）のですが、似たエピトープに対する反応性はロット毎で異なっている可能性はあります。その場合、「発表されている論文でもこの抗体を使って実験して」いるからといって、お使いのロットで同じ事ができるとは限りません。モノクロならば良いのでしょうが。 ここでの問題には関係無い話ですが。

(無題) 削除/引用 No.1664-6 - 2008/07/30 (水) 14:32:38 - キョロ TS様、ありがとうございます。 >（非リン酸化タンパクも検出できる）MEK1 Antibodyでも検出できませんか？ 同じ会社のMEK1 Antibodyも試してみましたが、この場合は、サンプルでの反応無し、かつ、なぜかポジコン（Phospho-MEK1 Antibodyではシグナルがあります）でもシグナルが出なくなってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.1664-5 - 2008/07/30 (水) 14:30:27 - うんと 蛋白量は十分ですか？

(無題) 削除/引用 No.1664-4 - 2008/07/30 (水) 14:27:24 - キョロ 早速ありがとうございます。 >その昆虫のキナーゼの想定されるリン酸化部位の周囲の配列は哺乳類MEK1と一致していますか。 結合部位の配列は一致しております。 既に、発表されている論文でもこの抗体を使って実験しておりますので、この点は確実だと思います。

MEK1 Antibodyでは 削除/引用 No.1664-3 - 2008/07/30 (水) 14:26:20 - TS （非リン酸化タンパクも検出できる）MEK1 Antibodyでも検出できませんか？ ひょっとするとその状態では、タンパクのほとんどがリン酸化されていないからPhospho-MEK1 Antibodyでは検出できないかも？

(無題) 削除/引用 No.1664-2 - 2008/07/30 (水) 14:19:26 - 中年 リン酸化特異的抗体のようにモノエピトープを認識する抗体の場合は、タンパク質の全長のホモロジーではなく、そのエピトープ（リン酸化部位とその周囲）が保存されていることが大切です。その昆虫のキナーゼの想定されるリン酸化部位の周囲の配列は哺乳類MEK1と一致していますか。

ウェスタンでのリン酸化タンパク質検出 削除/引用 No.1664-1 - 2008/07/30 (水) 13:59:53 - キョロ 現在、C社のPhospho-MEK1 Antibody（Human MEK1が抗原）でウェスタンを行っております。 ポジティブコントロールには、遺伝子配列上から相同性の高い動物種(鳥類卵・Human MEK1との相同性は約80%)から抽出したタンパク質を用いており、これは推定される分子量上にしっかりとしたシグナルが出ております。（ポジコンを購入できませんでしたので） 問題は、現在行っているサンプル(昆虫種卵・Human MEK1との相同性は約80%、他の論文にてこの抗体を使用して結果が出ております)にて、45kDaにシグナルが出ません。これはバックグラウンドが高くてシグナルが見えないのではなく、バックグラウンドも低い状態でシグナルが見えない状態です。 今までに、下記の条件を行ってみました。 １、抗体付属のプロトコール通り ２、ブロッキング試薬を、0.01% nonfat dry milk, 5 minやBSAの各種濃度 ３、ブロッキングをせずに、全過程に0.4% TBSTにて処理(現在は、この条件でポジコンにおいて一番綺麗な結果が出ます) ４、1次・2次抗体の濃度組み合わせ ５、SDS-PAGEでのサンプルバッファーの検討（2.5% 2-MEや50mM DTTの各種濃度、37℃、100℃の熱処理） 2次抗体は、Anti rabbit IgG conjugated to HRPを用い、コニカミノルタのイムノステインHRP-1000という化学発色試薬を用いて検出を行っております。 ポジコンではシグナルが出ているのですが、サンプルではあまりに発現量が少なくて化学発色では検出が不可能なのでしょうか？ 初めての書き込みなのですが、宜しくお願い致します。

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