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ありがとうございます。 削除/引用 No.1697-3 - 2008/08/06 (水) 21:22:12 - c-Myc おお様 返信ありがとうございます。 c-Mycのendogenousな発現が気になっていたのですが、やはり controlをしっかりと設定することでカバーしたいと思います。 それにしても、タグの選択ではいつも迷ってしまいます。 ある程度タグの選択条件を絞り込んだら、あとは実際にタグ付きタンパクを発現させて、どうなるか見てみるしかないってところもありますね。

(無題) 削除/引用 No.1697-2 - 2008/08/05 (火) 05:01:48 - おお myc-tagのエピトープはヒトとその他の生物種で違いがあり、タグように作られた抗myc抗体は、ヒトの配列を認識しますがたの生物種と交差しないようにできているものがあります(9E10とか)。ですから、マウスなどの細胞にmycタグを入れた物を発現して検出するのはリーズナブルだと思います。9E10はCOSでさえクロスリアクトがないそうです。 ですが、実際そういうふうに使うものとずっと思ってきたのですが論文ではよく人の細胞にほりこんだりしています。じっさいこの抗体では感度の問題なのか、c-mycのタンパクの状態によるものなのか分かりませんが、ヒトからのライセートでエンドを検出するのは難しいという感覚があります。人細胞内の局在のためＩＦもよく使われているようです。エンドは気になるところですが、ネガティブコントロールを常に意識しておけばいいのではと今は思ってます。特に細胞周期に関係ある物は注意が必要かもしれません。 タグは生理的なタンパクの役割を考えると小さいほうがいいですので、HA、myc、flagなどか昔からよく使われます、現在はバリエーションも増えていると思いますし、直接ある色素を認識するペプチドを使い抗体を介さないで見るというのもあるようです。サイトゾルや核のタンパク質であれば選択肢としてn末c末が考えられますが、n末とc末のIPで相互作用するものが見えたり見えなかったりとさが出てくることもしばしあり、タグが短いといっても一応機能面で何らかのチェックが必要と思います。ERなどで合成される膜タンパクなどはその性質上N末は避けるべきです。6xHisはしばしバックグランドが問題になります。 GFPなど大きなタグは全くダメかというとそうでもなく、大きいがゆえ立体構造的に外に露出する部分が多くIPでたいていのフラクションを落とせるという期待はできます。

タグの選択について質問 削除/引用 No.1697-1 - 2008/08/01 (金) 20:58:01 - c-Myc 基本的なことで申し訳ないのですが、質問をさせてください。 みなさんは、タンパクにタグを付ける時、何を指標にタグを選んでいますか。もちろん、WBで見たいのかIPしたいのか、大量精製するのかなど、目的によりけりなのはわかるのですが、そのようなノウハウを網羅しているような検索サイトもしくは成書などご存じの方がいらっしゃれば、教えていただきたいと思います。 たとえば、癌細胞にc-Mycでtaggingしたタンパクを発現させて、それをc-Myc抗体を使ってＩＦで局在解析ということは、しないほうがよいのかな、（もともとc-Mycが発現しているかもしれないため）とちょっと疑問に思いまして、いろいろ調べたいのですが。 よろしくお願いいたします。

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