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(無題) 削除/引用 No.1703-7 - 2008/08/07 (木) 17:35:25 - マチ > >NaClを加えるのも手としてあると思います。 > こちらも説明していただいてよろしいですか？ ポリリシンの正電荷と菌体の負電荷のインタラクションを見ている場合、これを阻害することによって再生されると考えられますので、イオン交換の原理と同様に、塩濃度もしくはpHを上げることで解離が生じると予想できます。ただし実際問題としてNaClだけで解離が出来るかといえばそうではなく、非特異吸着であったり、予期しない相互作用が出てくる場合があります。ということで、私であれば、 １．NaClによる再生を濃度で振って試す ２．10mM Gly-HClのpHを振って試す ３．10mM Gly-HClにNaClを加えた再生溶液を試す という感じでしょうか。 ただしこれも状況次第で変わってきます。NaClを使っても全く再生されない場合はGly-HClに混ぜて再生されるということも望み薄ですし、その場合はまた状況によって別の再生方法を試す必要があると思います。 もし本気で菌体をBiacoreで捕らえたいのであれば、SIA kitを買って金に自己組織化膜を形成させるのが一番経済的で効果が高いと思います。 自己組織化膜を作る試薬がやや高価ですが、長い目で見ればCM5を買い続けるよりも相当コストは低く済むかと思います。 特に特殊な装置も必要ありませんし、今はその領域はジャーナルがかなり出てますので、プルトコルもすぐそろいますし、お勧めです。参考までに。 もし興味があればまた仰って下さい。

(無題) 削除/引用 No.1703-6 - 2008/08/06 (水) 18:27:35 - niko ittiさん 確かに毎回取り出すと非効率ですよね。 チップが高価なので失敗したらと思うと二の足を踏んでいたんです。 おっしゃるとおり、もう少しシビアな条件でも考えたいと思います。 マチさん >Biacoreの標準プロトコルでは10mMのGly-HClを再生に用いていますが、 >この濃度を変えて100mMのGly-HClにすると同じpHでも随分と効果が異なります。 なるほど。濃度を変えるという発想がありませんでした。試してみたいと思います。 >NaClを加えるのも手としてあると思います。 こちらも説明していただいてよろしいですか？ >最後にこれはお節介かもしれませんが、CM5で菌体を測るのはお勧めできません。 >CMの層が長すぎるため結合した菌体がエバネッセント領域からはみ出てしまい、結果としてシグナルが弱まってしまいます。 確かにCM3の方が細胞などの巨大分子を扱うのに適していると説明があるのですが、手元にCM5しかないので使っています。 今後、より精密な測定が必要になってきたらCM3等CM層の短いもので測定することも検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1703-5 - 2008/08/06 (水) 00:22:05 - マチ 私も、ittiさんの言うとおりundockして再生するのはお勧めできません。 第一に手間がかかりますし、仮にundockして再生が出来たとして、 その後再びdockしたときにはベースラインは変化しますよね。 （シグナルが余程大きければ多少は無視できるのでしょうが） そうなれば、本当にセンサ表面に結合した菌体が解離してシグナルがベースラインまで戻っているのか、評価することはできませんので。 リガンドがポリリシンでしたらpHを変える以前に塩濃度も検討されてみてはいかがでしょう？ NaOHももちろん次の選択肢としては良いとは思いますが、 私でしたらGly-HClの濃度を変更するか、NaClを加えてみます。 Biacoreの標準プロトコルでは10mMのGly-HClを再生に用いていますが、 この濃度を変えて100mMのGly-HClにすると同じpHでも随分と効果が異なります。 リガンドが弱くてGly-HClを100mMにするのが怖いというのであれば NaClを加えるのも手としてあると思います。 また、NaOHをCM5にインジェクションするとベースラインが大きく変動することがあります。 うろ覚えですが、50mMNaOHではそのような挙動が出ていた気がします。 最後にこれはお節介かもしれませんが、CM5で菌体を測るのはお勧めできません。 CMの層が長すぎるため結合した菌体がエバネッセント領域からはみ出てしまい、結果としてシグナルが弱まってしまいます。 また何かあれば仰って下さい。

(無題) 削除/引用 No.1703-4 - 2008/08/04 (月) 12:31:09 - itti 中身を抜き出して溶液に浸すこと自体は問題ないと思いますが （ガラスをくっつけている接着剤がだめにならない限り）、 glycine-HClを使うのなら結果は同じような気がします。 それに、毎回取り出して再生をするのでは非効率では？ glycine-HClは抗体なんかにも使ったりする比較的マイルドな処理ですよね。 リガンドはポリリシンだそうですから変性の心配もないでしょうし、 通りすがりさんのようにNaOHなどもっとシビアな条件で再生しても 大丈夫なのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1703-3 - 2008/08/04 (月) 11:07:48 - niko 通りすがりさん、お返事ありがとうございます。 すいません。説明不足でした。 チップはCM5、再生時の速度はmedium(30μl/min)、時間は120秒です。 CM5にポリ-L-リシンを固定化し、そのポリ-L-リシンと菌体の相互作用を見ています。 再生では、菌体を取り除きたいのです。 一回の操作では再生量が非常に少ないので、上記の再生操作を5回ほど繰り返し行っていました。 ただ、最近特に再生不良が目立つので打開策は無いかと考えているところです。

(無題) 削除/引用 No.1703-2 - 2008/08/04 (月) 10:03:45 - 通りすがり センサーチップの種類は何ですか？ 再生するときの速度は何ul/sec？　何秒流してます？？？ もう少し詳しく書いて頂いた方がいいと思いますが・・・。 私はCM5に蛋白を固定化して、グリシンHClでは再生不良だったものが 50mM NaOHの再生液を60ul/sec×5secで流して再生できたことがあります。

センサチップ再生 削除/引用 No.1703-1 - 2008/08/03 (日) 23:26:56 - niko ビアコアを使用しており、再生溶液にpH3-1.5グリシン-HCl溶液を用いているのですが、あまり再生されません。(RU値がインジェクト前までさがらないのです。) いっそ、チップの中身を抜き出し、再生溶液に浸そうかと考えているのですが、このような多少荒っぽい方法でも大丈夫でしょうか？ ちなみにリガンドはポリ-L-リシン、アナライトは菌体を用いています。

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