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(無題) 削除/引用 No.1713-14 - 2008/08/19 (火) 10:16:42 - 組織 > 内因性ＰＯ除去したサンプルに、一次抗体と二次抗体を載せなくてＤＡＢ発色させたものは、発色しませんでした。 > 二次抗体を、ニチレイのrat組織用に変更して、実験しました。バックはややあるものの、以前よりずっときれいになりました。 この結果からすると、内因性ビオチンよりも二次抗体由来のバックかもしれませんね。一応、ビオチン、アビジンブロックされているわけですし。個人的には、ABC法はどうもバックが出やすい印象を持ってます。私のラボでは、数年前からポリマー系の二次抗体（ニチレイのシンプルステインやDakoのEnvisionなど）を使ってますが、バックが低く、コントラスト良く染まると感じでいます。何より操作が簡単なのが気に入っています。

(無題) 削除/引用 No.1713-13 - 2008/08/18 (月) 15:33:19 - motipon 　　組織様 　アドバイスありがとうございました。 　内因性ＰＯ除去したサンプルに、一次抗体と二次抗体を載せなくてＤＡＢ発色させたものは、発色しませんでした。二次抗体のみで、＋だったのでご指摘のように、内因性ビオチンによる発色と思われました。内因性ビオチンというのは、強いですねえ。それで、二次抗体を、ニチレイのrat組織用に変更して、実験しました。バックはややあるものの、以前よりずっときれいになりました。 　有難うございました。感謝です。

(無題) 削除/引用 No.1713-12 - 2008/08/08 (金) 15:40:30 - motipon 　ありがとうございます。 　最初に、組織の固定は冷アセトン固定20分しています。 　二次抗体はのせているので、次回は、のせないのもやってみます。 ＰＯブロック後に、アビジンブロッキング20分、ビオチンブロッキング20分していますが、たりませんか。 　免疫染色、難しいです。

(無題) 削除/引用 No.1713-11 - 2008/08/08 (金) 14:37:05 - 組織 >一次抗体を載せないでDAB発色させても、薄茶色に反応する部分があちます。 このネガコンでは二次抗体をのせてますか？もし二次抗体をのせていれば、POブロックあり、一次抗体も二次抗体もなしで発色させてみてください。二次抗体にABC法を使われているようなので、内因性ビオチンによる発色かもしれません。二次抗体なしで染まってくれば内因性POが原因と思いますが、染まらなければ内因性ビオチンを疑います。 ところで気になったのですが >ratの無固定凍結（腸管） 免疫染色前には固定されてますよね？

(無題) 削除/引用 No.1713-10 - 2008/08/08 (金) 13:29:10 - motipon 　　組織様 　お返事ありがとうございます。ratの無固定凍結（腸管）を、マウス一次抗体で免疫染色したいのです。アビジン、ビオチンブロッキングもしています。二次抗体はDAKOのrat組織用マウス一次抗体に使用できるものを使っています。一次抗体を載せないでDAB発色させても、薄茶色に反応する部分があちます。一次抗体をのせたのもは、強い発色がありましたが、ネガコンも発色したので困っていました。来週は、アザイドを加えて発色させてみます。他にも、対策があれば、お教え下さい。お願いします。

(無題) 削除/引用 No.1713-9 - 2008/08/08 (金) 09:48:27 - 組織 >motiponさん レスが遅れてすみません。DABに入れるアザイドですが、「酵素抗体法」では終濃度１０ mMになってますね。しかし、1晩も処理して抑えられないというのは、本当に内因性PO由来の発色でしょうか。POブロックだけやって、抗体をのせずにDABを反応させた時に染まりますか？もし全く染まってこないようであれば、抗体由来の非特異を疑った方がいいと思います。

アジ化ナトリウム 削除/引用 No.1713-8 - 2008/08/06 (水) 19:09:22 - motipon 　教えてください。おねがいします。 ＜DAB発色液にアジ化ナトリウムを加える＞は、濃度はどの位ですか。 　内因性ＰＯの除去で、0.3%過酸化水素in40%メタノールO.N.していますが、完全には除去できていません。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1713-7 - 2008/08/05 (火) 13:37:14 - 組織 抗原吸収ですが、一般的には希釈抗体に過剰量の抗原蛋白を加えて反応させ、遠心後に上清を取って組織にアプライします。 >抗体を使用する前に、別のスライドに一度抗体をかけて吸着させた後に、再度その抗体を使用する という方法も論文で見たことがあります。簡単にできますので、まずはこの方法を試してみるのも手だと思います。この場合、ポジコン組織を吸収用に使うといいでしょう。 ただ、 >好酸球が多い組織ですので好酸球のPOに反応しているのではないのかと言われた 今回は、内因性のPO（好酸球のミエロペルオキシダーゼ）を疑っているのであれば、こちらの検討を優先した方がいいかと思います。POブロック処理を強くする（反応時間を長くする）、もしくはDAB発色液にアジ化ナトリウムを加えてみて、シグナルが弱くなるorなくなるかどうかを確認されてはいかがでしょうか。もし好酸球のPOによる発色であれば、検出系をかえた方がいいかもしれません。AP系か蛍光免疫染色なら内因性PO活性を気にせずに染色できます。 >rabbit IgGをネガコンとして使うとしたら、一次抗体の代わりに組織にかけるのでよいのでしょうか？ その通りです。

(無題) 削除/引用 No.1713-6 - 2008/08/05 (火) 11:32:46 - ねが すいません。 rabbit IgGをネガコンとして使うとしたら、一次抗体の代わりに組織にかけるのでよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1713-5 - 2008/08/05 (火) 10:27:23 - ねが さっそくのご返事ありがとうございます。 ポジコンはDAB発色でかなり強く染まります。逆に陽性になる細胞が多すぎてネガコンをする必要が出てきたのです。（ちなみに好酸球が多い組織ですので好酸球のPOに反応しているのではないのかと言われたためです）。 抗原吸収というのは抗体を使用する前に、別のスライドに一度抗体をかけて吸着させた後に、再度その抗体を使用する、 といった内容でよろしいのでしょうか？ 勉強不足ですいません

(無題) 削除/引用 No.1713-4 - 2008/08/05 (火) 09:52:32 - 組織 非特異染色はある程度鏡検して判別できるので、ネガコンをあまり気にする必要はないと思ってます。シグナルが弱くて非特異なのか区別できない時に、抗原吸収処理をすればいいと思います。 個人的には、normal IgGはあまり参考にならないという印象です。

(無題) 削除/引用 No.1713-3 - 2008/08/05 (火) 09:40:33 - 組織 厳密にいえば、抗体を抗原吸収させてシグナルが減弱するか確認するのがより適したネガコンだとは思いますが、初めはrabbit IgGでいいんじゃないでしょうか。私もそうしてます。 それよりも、免疫染色ではポジコンの方が重要です。そもそも適切なシグナルを確認できないと、抗体がきちんと働いているかもわかりません。目的の抗原が豊富に存在する（と予想される）組織をポジコンにおきましょう。

(無題) 削除/引用 No.1713-2 - 2008/08/05 (火) 09:13:43 - とう >単なるIgGをネガコンとして使えるのでしょうか？それともanti　ラビットIgG抗体 そもそも、ラビット抗マウスなので、anti　ラビットIgG抗体はネガコンにはならないでしょう？ 語弊あり的に言うと、ポリクロなのでラビットIgGでいいでしょ？って言う事でしょう。まあ、メーカのの意図を推測で組み入れれば。モノクロではないので、フォールのIgGを選択するしか無い、、と思いますけど。 いいのでは？

免疫染色のネガコンの設定について 削除/引用 No.1713-1 - 2008/08/05 (火) 09:00:20 - ねが 免疫組織染色の素人です。 ある抗体で免染をしていますがネガコンの設定をどうするかで困っています。抗体はラビット抗マウスで、サンタ社のもので、その抗体のISOFORMの抗体を探していましたがなく、メーカーに問い合わせたところ　normal　ラビットIgG（抗体ではなく）をネガコンとして使えると回答が来ました。 単なるIgGをネガコンとして使えるのでしょうか？それともanti　ラビットIgG抗体などを使ったほうがやはり良いのでしょうか？ おしえてください

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