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(無題) 削除/引用 No.1724-13 - 2008/08/07 (木) 14:00:21 - Eco+RI あべちゃん 様 これはありがたいです。 ありがとうございました。 引き続き、Laemmliの系で分離した方の経験談をお伺いしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1724-12 - 2008/08/07 (木) 13:56:01 - あべちゃん Eco+RIさん、 インビトロジェンのホームページ内http://www.invitrogen.co.jp/electro/nupage.shtml にNuPAGEの分離能を示す図が有ります。 これはNuPAGEですが、原理はBis-Tris SDS-PAGEですので、参考になると思います。 10%固定のゲルで、MESとMOPSの場合を示してあります。 私が使った時は、MESでしたが、大体同じような感じです。 あと、invitrogenのカタログ（冊子）には、10%以外の分離能についても示されていたと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.1724-11 - 2008/08/07 (木) 13:27:01 - Eco+RI あべちゃん様 前の方の返信になりますが、 >running bufferをMOPSに代えるだけで、高分子領域にも使用できます。 >組成は、MESをMOPSに置き換えるだけです。 MOPSバッファーではどのくらいのタンパク質をカバーできるのでしょうか？ 小さなタンパク質からなる大きなコンプレックスを扱っておりまして うまい手法を模索中なのです。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1724-10 - 2008/08/06 (水) 23:43:09 - あべちゃん aimarさん、 はい、私はどちらでも泳動したことがあります。 sample bufferは一般的なlaemmliでOKです。

(無題) 削除/引用 No.1724-9 - 2008/08/06 (水) 20:56:31 - aimar あべちゃん様 ありがとうございます。 SDSはいれないのですね。 LDS sample bufferはSDS sample bufferで代用できるのであれば、SDS sample bufferを使おうと思います。 こちらにはSDSはいっていていいのですよね？ 何度もおたずねしてすみません。

(無題) 削除/引用 No.1724-8 - 2008/08/06 (水) 19:29:09 - あべちゃん aimarさん、 あまり意識していませんが、同じだと思います。 PAGE後の実験を含め、もう少し正確に言うと、 360 mM Bis-Trisは、4xの濃度でpH6.8に調整しています。 sample bufferはlaemmliでも良いですが、invitrogenの4x LDS sample bufferで最近は、調製しています。この際、変性は70度、10分です。 10% APSとTEMEDでポリ化させてます。 10% APSは300分の1、TEMEDは1500分の1量加え、だいたい10−15分で完全にポリ化します。 ゲル内にSDSが含まれていないのは、忘れていたのでは無く、本当に入れていません。 ミニゲルで40 mA定電流で流しています。ゲル板によって、電流量は違うと思いますが、電圧120Vくらいだと思います。だいたい3時間弱です。 CBB染色も普通のSDS-PAGEと同様にやっています。 PVDF膜へのブロットはbio-radのセミドライ式で、1x towbin buffer with 20% EtOH and 0.037% SDS、で12V 30 minで行えます。60kDa以下の蛋白質ならば、だいたいは問題なく転写されます。

(無題) 削除/引用 No.1724-7 - 2008/08/06 (水) 19:11:51 - aimar あべちゃん様 ついでながら教えてください。 Bis-Tris/MESの電気泳動についてですが、下記の組成以外(SDSなど)は通常のSDS-PAGEと同様でよいのでしょうか？

6M urea 削除/引用 No.1724-6 - 2008/08/06 (水) 18:08:45 - 758 通常のLaemmliの系で，分離ゲルに6M urea（アクリルアミドは15-18%くらい）を加えると，低分子量のタンパク質のバンドのシャープさがかなりよくなります。 7-10kDaの検出は問題なかったと思います。 insulinのβ鎖（3.5k）もいけたような気がしますが，はっきりとは覚えていません。

(無題) 削除/引用 No.1724-5 - 2008/08/06 (水) 17:35:43 - Eco+RI あべちゃん 様 詳しいプロトコール、ありがとうございます。 低分子を分離しなければならないだろうから、ぜひやってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1724-4 - 2008/08/06 (水) 17:31:32 - あべちゃん MES running buffer 50 mM MES, 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 0.5% SDS pHは調整する必要有りません。私は20xストックを作ってます。あと、泳動直前に5mMになるようにsodium disulfiteを添加していますが、必須では無いです。泳動中の酸化を防止するために添加。 32% acrylamide stock 30% acrylamide, 2% bis-acrysamide separation gel 10 or 12% acrylamide/bis-acrylamide 360 mM Bis-Tris [pH 6.8 adjusted with HCl] stacking gel 4% acrylamide/bis-acrylamide 360 mM Bis-Tris [pH6.8 adjusted with HCl] サンプルバッファーはlaemmliのバッファーを使っています。 BPBは、3kDa付近を示します。 running bufferをMOPSに代えるだけで、高分子領域にも使用できます。 組成は、MESをMOPSに置き換えるだけです。

(無題) 削除/引用 No.1724-3 - 2008/08/06 (水) 16:50:10 - Eco+RI あべちゃん 様 ありがとうございます Bis-Trisゲル/MESバッファーの系は存じております。 インビトロジェンからでていますよね。 3 kDa まで見えますか、すごいですね。 プレキャストを買うほど余裕がないので、 できればゲルやバッファーの組成を教えて頂けないでしょうか？ もしくは、記載されている文献やHPなどはご存知でしょうか？ 一度、Tricineでやってみて、面倒だなぁと思ったことがあります。 ゲル液にSDSが入っていたり(脱気で泡立つ！)、ゲルが３段だったり、泳動時間が長かったり… Bis-Tris/MESはどうなのでしょうか…

(無題) 削除/引用 No.1724-2 - 2008/08/06 (水) 14:47:14 - あべちゃん EcoRIさん、 質問の意図とは異なりますが、Bis-Trisの中性ゲルで、MESバッファーを使えば3kDaくらいまで分離可能です。 わたしは、6kDa弱の蛋白質を調べる事がよく有りますが、ちゃんと分離できますよ。アクリルアミドも10%あるいは12%で良いです。

10 kDa 以下のタンパク質の分離 削除/引用 No.1724-1 - 2008/08/06 (水) 11:31:39 - EcoRI お世話になっております。 SDS-PAGEにおけるアクリルアミド濃度についての疑問です。 一般的に、10 kDa 程度かそれ以下のタンパク質(サイトカインなど)やペプチドを分離するには、 Laemmliの系では不適当とされ、 Tricineの系でやるべき、とされていますし、実際その通りだと思います。 一方、Laemmili 法の変法で、分離ゲルに少し濃いめのTrisとGlycerolを仕込んで、 アクリルアミド濃度を18%まで高める方法もあります。 この方法で、低分子のタンパク質を分離したことがある方はいらっしゃいませんでしょうか？

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