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トピ主です 削除/引用 No.1725-14 - 2008/08/12 (火) 19:00:08 - aimar Urea入りでサンプルを調整し、Niカラムにかけたところ、目的タンパク質が検出されました。 Nativeな状態と溶出してくるタイミングは若干異なりますが、これなら目的タンパク質の精製が出来そうです。 皆様、アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1725-13 - 2008/08/07 (木) 19:38:42 - りょう カラムに通して、溶出後に樹脂の一部をSDSサンプルバッファーでboilして、詰まっているかどうかチェックされましたか？ 不溶化して詰まっているならやはり変性剤入りの状態でカラムワークするのが得策でしょう。

(無題) 削除/引用 No.1725-12 - 2008/08/07 (木) 14:23:10 - aimar 怠け者様 スルー画分や洗浄などにも検出されません。そのことは確認済みです。 おお様 アドバイスありがとうございます。 フレッシュなものを作りやってみます。

(無題) 削除/引用 No.1725-11 - 2008/08/07 (木) 11:54:11 - おお 尿素で気をつけないといけないのはリジンの修飾だったかと思います。長期間特に室温とかでさらすと徐々に修飾されるようです。尿素はなるべくフレッシュな溶液をつくり、カラムで分離後は速やかに取り除くのがいいかと思います。抗原としてなら多少乱暴でもいいかもしれませんが、マスでの解析とかでは使ったりはするものの、気をつけろというお言葉をいただいたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.1725-10 - 2008/08/07 (木) 11:25:18 - 怠け者 カラムをスルーしたところや、洗浄のところは調べていないのですか？

(無題) 削除/引用 No.1725-9 - 2008/08/07 (木) 11:19:08 - aimar タンパク質がどこへ行ってしまったかは、頭の痛いところなのですが、 1.カラムにかける前のサンプル中には存在している。少しの間ほかっておいてもなくならない。 2.カラムからの溶出画分にはない。NiをEDTAではがした画分にも存在しない。 3.バッファーの条件等からカラム溶出後に分解したとは考えにくい。 です。 カラム内で不溶化しているという可能性は棄却できないので、unknownな分解も含めて考えて、Ureaで処理してカラムワークをしようと考えています。

(無題) 削除/引用 No.1725-8 - 2008/08/07 (木) 11:04:50 - 名無し 蛋白質が得られないということですが、その蛋白質はどこにいってしまったのでしょうか？１）カラムに強くくっついて出てこないのですか。２）精製中に不溶化してカラム上部に詰まっているのですか３）カラムにかける前から壊れてなくなってしまったのですか。４）カラムから出たあとに分解や容器器壁等への吸着でロスしてしまったのですか。それによって対策は変わってくると思います。

(無題) 削除/引用 No.1725-7 - 2008/08/06 (水) 19:17:55 - Skeptic プロテアーゼに依らないタンパク質分解とは、どのようなことを想定されているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1725-6 - 2008/08/06 (水) 19:13:28 - aimar Eco RI様 確認いただきありがとうございます。 活性や立体構造などは保持されていなくとも全くかまいません。 一度チャレンジしてみます。

(無題) 削除/引用 No.1725-5 - 2008/08/06 (水) 16:42:50 - Eco RI Urea で目的のタンパク質が変性していれば、プロテアーゼも変性してるでしょうから、 ランダムな分解はなくなると見積もることができますよ。 おおさんの仰るように、GuHClや、Tritonを用いるのも手です。 もうひとつ、変性させたタンパク質は、もはや活性や立体構造を失っています。 そのようなタンパク質では、western用の抗体作製のための免疫原とするぐらいにしか、 用途がありません。 もしかすると、そのような意図で精製をなさっているのかもしれませんが、念のため。 巻き戻す、というのもありますが、労力の割にあまり報われない結果になることも多いようです。

ありがとうございます 削除/引用 No.1725-4 - 2008/08/06 (水) 16:10:29 - aimar 早々にお答えいただきありがとうございます。 8M Ureaでやってみようと思います。 それだけ高濃度なら、全タンパク質が変性すると期待していいのでしょうか。 立体構造が解けて逆にプロテアーゼで切れやすくなるなどしないか若干心配ですが、とりあえずやってみます。

(無題) 削除/引用 No.1725-3 - 2008/08/06 (水) 14:25:43 - おお EcoRIさんの仰るようにSDSはHIS用のNiカラムはによくないようです。違う変性剤を使ってください。-6 M 塩酸グアニジン、-8 M 尿素はよく使われる変性剤です。TRITON X-100などで可よう化できるのであればそれでもいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1725-2 - 2008/08/06 (水) 13:59:36 - EcoRI QIAGEN の Ni-NTA Aagarose では、 Ni-NTA-6xHis相互作用に影響を及ぼさない試薬* 6 M 塩酸グアニジン 50% グリセロール 8 M 尿素 20% エタノール 2% Triton&#174; X-100 2 M NaCl 2% Tween&#174; 20 4 M MgCl2 1% CHAPS 5 mM CaCl2 20 mM β-ME <20 mM イミダゾール とあり、SDS はダメなようです。 尿素で変性してみてはいかがでしょうか？ 尿素なら SDS-PAGE に影響を与えにくいですから

SDS化したタンパク質の精製 削除/引用 No.1725-1 - 2008/08/06 (水) 13:31:16 - aimar 現在、His tagを付加したタンパク質の精製を行っています。 ウエスタンブロッティングでは目的のタンパク質がしっかり検出されるにもかかわらず、Niカラムを用いて精製すると、目的のタンパク質が全く得られません。 プロテアーゼインヒビターカクテルはしっかり加えているので、プロテアーゼによる分解は考えにくいので、unknownな分解によって、分解されてしまっているのか、と考えています。 同じNiカラムを使って、別のタンパク質を精製すると、それはしっかり精製できるのでカラム内に不純物が混ざっているとは考えにくいです。 そこで、sample bufferでsample化したものをつかってNiカラムにかけようかと思ったのですが、His tagの部分にもSDSが結合しているし、これでは無理なのでしょうか？ 使っているNiカラムはメルカプトエタノールは20mMまで大丈夫です。 ご存知の方、ぜひとも教えてください。 よろしくお願いします。

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