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返信ありがとうございます。 削除/引用 No.1744-14 - 2008/08/13 (水) 11:55:49 - 30 ＞いえ、これはあたらないと思います。 　dualの場合はpromoterの干渉、もっというなら転写因子の取り合いがあるの　で 　一番目のgeneの発現量が、dualの方がIRESのときより発現が落ちる可能性が　あると思います。 　ただし、dualやIRESに関わらず組み込んだ遺伝子の発現量はpromoterと細胞　の相性や骨格に組み込まれている遺伝子の問題、plasmidの大きさなども関　与しますからこの点はdualかIRESかだけでは結論が出ないと思います。 　発現量の違いについての結論を求めるならば、それはやってみるしかないで　しょう。 よくわかりました。 転写因子の取り合いがあるかないか、においては、 遺伝子の発現量はdualかIRESかで変化する可能性があるが、 それ以外の要素も関わってくるため、実際は入れてみないと わからない、と考えてよいでしょうか。 ^さんがおっしゃるように、 ＞IRESならば、2つの遺伝子の転写が同時に行われますので、 　2つの遺伝子の発現効率はそれなりに相関があるでしょう。 　逆にそれぞれの発現量比を変えることは難しいでしょう。 二つの遺伝子の発現量比という点では、 dualとIRESではIRESの方がその発現の相関があって、 目的の遺伝子のモニタリングをしやすいと考えればよいのでしょうか。 (ちょっとまた大雑把な言い方になったかもしれませんが。) 私の質問の仕方がいたらず、 本題から少し議論がそれてしまったこと、すみませんでした。 でも、自分の中で疑問が晴れました。 又質問以外の点でも知識がつきました。 いろいろとご教授ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1744-13 - 2008/08/12 (火) 16:00:26 - IRES > 私はタンパク融合遺伝子を用いるのは避けたかったこと > (タンパク機能が変化する可能性を考慮して)、 > 又生きた細胞に、遺伝子カクテルとして入れてしまうのではなく、 > 光った細胞が必ずその目的の遺伝子が発現した状態に > したかったために、IRESかdual promoterを考えていた次第です。 この場合はIRESの方がより良いでしょう。 ただ、前の議論のように一番目のgeneによっては二番目のgeneの発現が弱くなる場合があるので、その場合はもっと検出しやすいものを二番目に入れ直すなどの工夫が必要でしょう。 > 私の最初の質問に戻りますと、 > IRESとdual promoterによる > ベクターに乗った二つの遺伝子の発現効率というのは > 違うかどうかは原理的には特に差はない、 > と考えてよいのでしょうか。 > 私の最初の > 質問がうまく伝わっていないかもしれませんが、 > 今一度教えていただきたいです。 いえ、これはあたらないと思います。 dualの場合はpromoterの干渉、もっというなら転写因子の取り合いがあるので 一番目のgeneの発現量が、dualの方がIRESのときより発現が落ちる可能性があると思います。 ただし、dualやIRESに関わらず組み込んだ遺伝子の発現量はpromoterと細胞の相性や骨格に組み込まれている遺伝子の問題、plasmidの大きさなども関与しますからこの点はdualかIRESかだけでは結論が出ないと思います。 発現量の違いについての結論を求めるならば、それはやってみるしかないでしょう。 dualとIRESの大きな違いはどちらに組み込んだ方がより発現量が増えるかではなくて以前にコメントしたとおりだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1744-12 - 2008/08/12 (火) 15:08:11 - ~ >違うかどうかは原理的には特に差はない、 プロモーターが1個か2個かで十分差があると思いますが、 どの程度の違いまでを差が無いとみなすのですか？ 1つの細胞に2つの遺伝子を同時に発現させることが出来るだろうという意味では、同じといっていいでしょう。 IRESならば、2つの遺伝子の転写が同時に行われますので、 2つの遺伝子の発現効率はそれなりに相関があるでしょう。 逆にそれぞれの発現量比を変えることは難しいでしょう。 mRFPの発現量が高すぎて、細胞に影響が出るかもしれません。(コントロールでも細胞が死んだりするかもしれません) IRESの下流側の遺伝子が発現しないのは事故と思うしかないと思います。使用する細胞などでIRESを使えるかどうかの検討をするくらいならば、本番をやったほうが早いでしょう。 Dual promoterであれば、発現量はそれぞれのプロモーターしだいですので、 2つの遺伝子の発現効率はやってみなければわからないでしょう。 片方だけしか発現しない場合があってもおかしくありません。 あえて片方を弱いプロモーター(mRFPにTKプロモーターをつけるなど)にして発現量比を調節しようとすることも出来ます。(期待通りに行くとは限りませんが)

返信ありがとうございます。 削除/引用 No.1744-11 - 2008/08/12 (火) 11:32:28 - 30 おかげで IRESさんのおっしゃってた事がわかりました。 又、 ＞私はIRESの強みはなんといっても二番目のgene例えばGFPを良く使います　　が、これの発現を見ることで、細胞を生かしたままで、間接的ではあります　が一番目のgeneの発現動態を見ることが出来るという点だと思います。 ということや、CMVさんのおっしゃる >もし、レポーター遺伝子(EGFPなど）との融合蛋白質発現系でもかまわないのであれば、この策を取ったほうが難しいことを考えなくてよいかもしれません。目的によりますので、よく考えて。 への答えになるかと思いますが、 私はタンパク融合遺伝子を用いるのは避けたかったこと (タンパク機能が変化する可能性を考慮して)、 又生きた細胞に、遺伝子カクテルとして入れてしまうのではなく、 光った細胞が必ずその目的の遺伝子が発現した状態に したかったために、IRESかdual promoterを考えていた次第です。 私の最初の質問に戻りますと、 IRESとdual promoterによる ベクターに乗った二つの遺伝子の発現効率というのは 違うかどうかは原理的には特に差はない、 と考えてよいのでしょうか。 私の最初の 質問がうまく伝わっていないかもしれませんが、 今一度教えていただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.1744-10 - 2008/08/12 (火) 10:05:19 - IRESあらためECMV 最初のIRESさんへ すみません、ハンドルネームが重複しておりました。 ハンドルネームを改めます。 ハッカクさま > ただし、IRESを用いる場合、細胞系により、IRES下流の発現が確認されない場合もあります。 ＞横レスすみません。 ＞上記のこと初めて聞きました。 ＞具体的にどのような細胞が該当するか（規則性、もしくは細胞株のリスト ＞など）ご存知でしたらご教授いただけますか？ 私が用いているコンストラクトをいくつかの細胞株に導入して、IRES下流の遺伝子の発現をチェックした際にみられたものです。 規則性があるかといわれると判りません。私の経験では、細胞によるとしかわかりません。 スレ主のかたへ もし、レポーター遺伝子(EGFPなど）との融合蛋白質発現系でもかまわないのであれば、この策を取ったほうが難しいことを考えなくてよいかもしれません。目的によりますので、よく考えて。 当然ですが、得たい結果に対して、取るべき方法はたくさんあります。どの方法が自分にあっているか、また、論理的に成っているかということを考えて、取るべき手法を取捨選択してください。

(無題) 削除/引用 No.1744-9 - 2008/08/11 (月) 23:22:19 - IRES >[Re:8] 30さんは書きました : > ただ私がよく一番目のIRESさんに > 教えていただいたことを理解できていないのですが、 > dual promoterの場合(例えばCMVproとSV40proなど)、 > 二つのプロモーターに対する転写因子が干渉することを > 考えると、競合によりむしろIRESのほうが発現量が増えそうな > 気がするのですが、どういうことなのでしょうか。 これは誤解を与えてしまったかもしれないですね。 言葉が足りませんでした。申し訳ありません。 IRES依存的に二番目のgeneを発現させた場合と、single promoterで同じgeneを発現させた場合、後者の方が発現が良い場合が多いという意味です。 > とありましたが、当然クローンによっては片方しか出ていない可能性という > のは、どうやったら確認できるのでしょうか。 > またそのような状況はなぜ起こるのでしょうか。 確認する方法はWBなどで宜しいのではないでしょうか。 また、片方しか出ない場合と言うのは例えばgenomeに組み込まれたplasmidが運悪く片方のpromoterがdefectしていた場合などです。 これに対してIRESの場合はsingle promoterにより発現が支配されているので defectしていればどちらも出ないので扱いやすいと思います。 また、細胞によってはCMVはよく発現するがSV40、EFaはいまいちなんていう場合も経験していますので、こういった可能性もありますね。 私はIRESの強みはなんといっても二番目のgene例えばGFPを良く使いますが、これの発現を見ることで、細胞を生かしたままで、間接的ではありますが一番目のgeneの発現動態を見ることが出来るという点だと思います。

なるほど。 削除/引用 No.1744-8 - 2008/08/11 (月) 19:52:01 - 30 ただ私がよく一番目のIRESさんに 教えていただいたことを理解できていないのですが、 dual promoterの場合(例えばCMVproとSV40proなど)、 二つのプロモーターに対する転写因子が干渉することを 考えると、競合によりむしろIRESのほうが発現量が増えそうな 気がするのですが、どういうことなのでしょうか。 又、 ＞とにかく両方とも強く発現させたい場合(当然クローンによっては片方しか　出ていない可能性もありますが...)はdual promoterを用いています。 とありましたが、当然クローンによっては片方しか出ていない可能性という のは、どうやったら確認できるのでしょうか。 またそのような状況はなぜ起こるのでしょうか。 初歩的な質問ばかりで申し訳ないです。 よろしく御願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1744-7 - 2008/08/11 (月) 18:01:52 - IRES > IRESはその両側に入った遺伝子を一つの転写産物として > 作ってから、二つのタンパク質を作る、という感じですよね。 > 一方で、dual promoterだと、二つのプロモーターに > それぞれ転写因子が結合して、それぞれ転写・翻訳される。 そうです。 このこととpromoter間での転写因子の干渉がどういうことかを考え合わせると答えが得られるかと思います。 私も往々にしてIRESを用いた場合はIRESより後ろの遺伝子発現というかタンパク質発現がダイレクトにCMVなどのpromoterを用いたときより弱いように感じています。 ただ、IRESを用いた方が理論的にはIRESより後のタンパク質発現(GFPなど)とIRESより前の遺伝子のタンパク質発現量に相関があるのでモニタリングしやすいと思いますので、こういったことが必要な場合はIRESを、とにかく両方とも強く発現させたい場合(当然クローンによっては片方しか出ていない可能性もありますが...)はdual promoterを用いています。 ちなみに２番目のIRESさんと一番目のIRES(私)は同一人物ではありません。 ハンドルネームは重複しないようにしていただけると有難いのですが...

お答えありがとうございます。 削除/引用 No.1744-6 - 2008/08/11 (月) 17:34:56 - 30 ＞dual promoterによる発現系と、IRESを用いるdual expression系による発現　系の違いを考えてみてください。 IRESはその両側に入った遺伝子を一つの転写産物として 作ってから、二つのタンパク質を作る、という感じですよね。 一方で、dual promoterだと、二つのプロモーターに それぞれ転写因子が結合して、それぞれ転写・翻訳される。 そうなると、転写の効率の違いが出てくるのではないかと思うのですが、 みなさん、どのように使い分けられているのかと思ったので 伺いました。 先の質問はアバウト過ぎましたよね。汗 ただ、 ＞ただし、IRESを用いる場合、細胞系により、IRES下流の発現が確認されない　場合もあります。 とありましたように、入れてみないとわからないような ところもあるのかもしれません。(特に私はvivoで入れようと考えているので。) 又、以下おっしゃっていたように、 ＞一般的かどうかはどのように判断していいか分かりませんが、 　PCAGGS-IRES 　をgoogle scholarで検索すると、約 64件がヒットしました。 ネットで使っている人の論文を まじめにあたってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1744-5 - 2008/08/11 (月) 13:12:57 - ハッカク > ただし、IRESを用いる場合、細胞系により、IRES下流の発現が確認されない場合もあります。 横レスすみません。 上記のこと初めて聞きました。 具体的にどのような細胞が該当するか（規則性、もしくは細胞株のリストなど）ご存知でしたらご教授いただけますか？

IRESの意味を調べてください 削除/引用 No.1744-4 - 2008/08/11 (月) 12:59:57 - IRES dual promoterによる発現系と、IRESを用いるdual expression系による発現系の違いを考えてみてください。 IRES: Internal ribosome entry siteです。 ただし、IRESを用いる場合、細胞系により、IRES下流の発現が確認されない場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.1744-3 - 2008/08/11 (月) 11:27:46 - ~ >CAGGS-IRESの組み合わせでも一般的に使われているのでしょうか。 一般的かどうかはどのように判断していいか分かりませんが、 PCAGGS-IRES をgoogle scholarで検索すると、約 64件がヒットしました。 IRESの後ろも、neo,bleo,GFP,puro,NLS-GFPなどがありました。

(無題) 削除/引用 No.1744-2 - 2008/08/11 (月) 10:43:19 - IRES IRESとSV40 pro.がどのようなものかお調べになられると良いかと思います。 IRESベクターの取扱説明書には記載されていませんでしたか？

IRES vectorについて 削除/引用 No.1744-1 - 2008/08/08 (金) 21:19:43 - 30 今、遺伝子導入ｺﾝｽﾄﾗｸﾄの設計初心者のものです。 初歩的な質問かもしれませんが、よろしく御願い致します。 私はCMV(プロモーター)-IRES-mRFP1あるいはCMV-SV40-mRFP1に インサートを入れて、mRFPと目的の遺伝子を 発現させたいと考えています。 そこで、確認になるのですが、 CMV-IRESは、CMV-SV40と比べて プロモーターに対する転写因子の競合がない、という 話を聞いたことがあるのですが、具体的には どのように両者は違うのでしょうか。 又、CMVプロモーターで発現が弱かった場合、CAGGSプロモーターに のせ変えようと思っているのですが、 CAGGS-IRESの組み合わせでも一般的に使われているのでしょうか。 また、以上のようなベクターに関して詳しい情報が載っている サイトがありましたら、教えていただけませんか。 ご教授よろしく御願い致します。

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