前に免疫沈降がなんかどうも---という質問をしていろいろ教えてもらったものです。その節はありがとうございました。いろいろ考えて、ダメ元でお盆休み前にもういちどやったら回収率がよくなったので報告します。改良点は1)SDS変性のとき10mMbMEと5mMEDTA(いずれも最終濃度）を入れて95C, 5分加熱した。EDTAをここで何でこんなに入れるのか分かりませんが、ネットで遊んでてたまたま見た記事にそういうのがあったので入れてみました。あんまり関係ないかもしれません。理由知ってる人いたら教えて下さい。2)抗体量を前の２倍の2μgにして、proteinAビーズも２倍にした。3)抗原抗体反応は前は室温で1~2時間くらいだったのを、今回は4Cで10時間やってみた。の３点です。あとは前と同じ条件です。前は回収蛋白質をそれに対する抗体でWBで調べてもシグナルが非常に薄くてかなり長くexposeしてはじめてコントロールの方と比べてようやくほんのすこしなにか見えるかなあというくらいだったのですが、今回はすぐに明瞭に目的の蛋白質の位置にシグナルがバッと見えました。なんか前と全然違うという感じです。もちろんコントロールや抗体だけのレーンにはそれは見えませんので本物とおもいます。いろいろ考えたのですが時間を長くしたのがよかったような気がします。経験では、室温で短時間でもふつうにイケる抗体もあるので、この抗体の場合は抗原-抗体の安定なコンプレックスが出来るまで時間がかかるのかもしれません。
もしも同じような問題を抱えた時参考にしてもらえたらとおもい書きました。（この実験の最終目的は修飾体を認識する別の抗体でWBするpull-downです。それはお盆休み明けたらやろうと思っています。） |
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