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(無題) 削除/引用 No.1748-6 - 2008/08/12 (火) 19:12:49 - りょう 逆に根本的な質問ですが、膜画分に存在することを示したいのですか？ 単に、骨格筋にも発現しているということを示したいのですか？ 前者なら「GLUT4さん」が提案された方法で検討されたら良いでしょうが、後者なら分画によるロスが怖いのでRIPAあるいはSDS-PAGEサンプルバッファーなどでtotal lysateを得て、かなり多めにアプライして泳動されてはいかがでしょう。 IPに使える抗体なら、RIPA抽出物などをIPしてコンテントが少なそうな12回膜貫通蛋白を濃縮するのも良いのでは。

(無題) 削除/引用 No.1748-5 - 2008/08/11 (月) 11:25:44 - GLUT4 私は骨格筋の膜タンパクをよく見ますが、やはりミオシンなどの筋原線維が多いので筋原線維を可溶化して超遠心で膜タンパクを沈殿させることをお勧めします。 下記の文献を参考にするとよいと思います。 �@PMID: 17998027（W.B. GLUT4の項） �APMID: 8760092 �@のほうが比較的簡単なプロトコルで、�@で検出できないのなら少しややこしいですが�Aでやれば検出できるのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1748-4 - 2008/08/10 (日) 02:26:19 - おお >[Re:3] sss2さんは書きました : > 早速のコメントありがとうございます。 > 可溶化の条件をマイルドにする、というのは思いつきませんでした。むしろ、可溶化していないからもっとdetergentを増やした方が良いのかなと考えていました。 筋肉のコンポーネントをなるべく減らせるなら、相対量が上がるだろうなと、イメージしてます。 目的のフラクション以外をウエスタンすると、可よう化してないのであれば可よう化バッファー処理後のペレットに来ているのが確認できるかもしれません。 膜フラクションを取ることができれば解析がしやすいですが、骨格筋においてどうしたらいいのかと言うのは調べたこともありませんので、、、、 発現の検出が目的であれば免疫染色でもいいのではないでしょうか。

＞おおさん 削除/引用 No.1748-3 - 2008/08/09 (土) 17:22:05 - sss2 早速のコメントありがとうございます。 ＞骨格筋での発現は確信があるのでしょうか? 骨格筋に存在することは、ノーザンブロット等によってよく知られています。ただ、その量は腎臓に比べておそらく少ないかもしれません。 ＞50 mM Tris, 15 mM NaClこれは可也低張のように思えますが 申し訳ありません。NaClは150mMの書き間違いでした。 ＞あとはプロテアーゼインヒビターは加えてますよね はい、ペプスタチンとロイペプチン、PMSFを加えています。 可溶化の条件をマイルドにする、というのは思いつきませんでした。むしろ、可溶化していないからもっとdetergentを増やした方が良いのかなと考えていました。 マイルドにすると膜タンパクの含有率を上げられるのですか？余分なタンパクを可溶化させずに遠心して、pelletへ除去できるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1748-2 - 2008/08/09 (土) 15:01:55 - おお >[Re:1] sss2さんは書きました : > 初めまして。 > 細胞膜に存在する12回膜貫通型タンパクを抽出し、ウエスタンにて発現量を見たいと思っています。 > > 今行っているサンプル調製は以下の通りです。 > 1. 組織にホモジナイズバッファー（50 mM Tris, 15 mM NaCl）を加え、ポリトロンでホモジナイズ。 > 2. 3000g, 5分の遠心をかけて、上清をとる。 > 3. 可溶化バッファー（150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, and 50 mM Tris, pH 7.5）を加えて撹拌。 > 4. 10,000g, 15分で遠心をした後の上清をとる。 > 5. sample bufferを加えて、室温で30分間ローテーションする。 > 6. 1レーンに30ugのサンプルをアプライして電気泳動。 > 骨格筋での発現は確信があるのでしょうか? これは腎臓のプロトコールでしょうか? 50 mM Tris, 15 mM NaClこれは可也低張のように思えますが150mMのような気もしますがどうなんでしょうか。 膜タンパクということですので最初のこの処理で膜がバラバラになってしまっているかもしれません。 特に骨格筋は細胞は融合し、細胞間の結合もタイトだと思いますので、、、 ですから最初のこのステップを踏まずに、いきなり可溶化バッファーをくわえ、ポリトロンで破砕、溶解をして ライセートを得ても良いかと思います。 あと骨格筋はやたらタンパクの多い組織です特にミオシンとか筋肉の働きに関するものが可也の量を占めると思います。ですから、同じ30ugと取ってきても膜タンパクの含有率とか低いかもしれません。可溶化の条件をもう少しマイルドにしても良いかとも思います。デタージェントをTRITONだけにするとか、グリセロールを加えるとかです。 経験と言うよりは、ちょっ感的なものです。経験のある人の意見も聞きたいところですね。どなたかフォローしていただければいいのですが。 あとはプロテアーゼインヒビターは加えてますよね(一応念のための質問です)?

骨格筋の膜タンパク 削除/引用 No.1748-1 - 2008/08/09 (土) 13:45:19 - sss2 初めまして。 細胞膜に存在する12回膜貫通型タンパクを抽出し、ウエスタンにて発現量を見たいと思っています。 腎臓ではバンドが得られているのですが、私が注目している骨格筋ではバンドが出なくて困っています。骨格筋だと組織が固いため、膜タンパクを抽出するのが難しいというのを聞いたことがあります。やはり、骨格筋では他の組織と違ったサンプル調製を行わなければいけないのでしょうか？ 今行っているサンプル調製は以下の通りです。 1. 組織にホモジナイズバッファー（50 mM Tris, 15 mM NaCl）を加え、ポリトロンでホモジナイズ。 2. 3000g, 5分の遠心をかけて、上清をとる。 3. 可溶化バッファー（150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, and 50 mM Tris, pH 7.5）を加えて撹拌。 4. 10,000g, 15分で遠心をした後の上清をとる。 5. sample bufferを加えて、室温で30分間ローテーションする。 6. 1レーンに30ugのサンプルをアプライして電気泳動。 みなさまのご教授いただけたら幸いです。

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