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(無題) 削除/引用 No.1755-5 - 2008/08/13 (水) 13:04:26 - ~ IEFでリン酸化されているものと分けれませんかね？ そうすればバックグラウンド(リン酸化されていないシグナル)は下がると思います。 2Dだと、リン酸化の個数に応じて横にずれていきますので。

(無題) 削除/引用 No.1755-4 - 2008/08/13 (水) 10:46:33 - aji どちらの場合もmass specで読む、が出口ですがMSをお持ちでしょうか？ IMACで選択かければバックグランドが下がり検出感度が格段に上がるのでkinaseの共発現なしにリン酸化が見えるかも、と考えるのは期待しすぎでしょうか。 MSが外注（内部施設も含めて）でただのフィンガープリンティングとしてしかデータが得られない場合には蛙王さんのご指摘のようにリン酸化されている比率が高いことが大前提のようです。

(無題) 削除/引用 No.1755-3 - 2008/08/12 (火) 17:09:27 - 蛙王 各々の特徴についてはＧＥさんの仰るとおりだと思います。 いずれの方法をとるにせよ、リン酸化の効率が十分に高いことが感度の上からは大切であるようです。出来れば移動度の差などでリン酸化フォームのみを回収できれば理想的です。

(無題) 削除/引用 No.1755-2 - 2008/08/12 (火) 17:03:48 - ＧＥ 前者の方は、ＩＰの効率や非特異的タンパク質吸着を考慮しなくてはなりません。また、仮にリン酸化されていても、それが強制発現させたkinaseによるダイレクトなものか、それともそのkinaseに活性化された別のkinaseによるものか同定しなくてはなりません。でも、in vivoでのリン酸化サイトを同定できます。 後者の方は、精製されたタンパク質を大量に用いるので、コンタミの可能性も低いですし、簡単にリン酸化タンパク質を得ることが出来ると思います。リン酸化されたサイトは目的のkinaseによってリン酸化されたといえます。ただし、in vivoでのリン酸化を必ずしも反映しているとは限りません。つまり、in vitroなので非特異的なサイトをリン酸化する可能性もあります。 どちらも一長一短だと思います。自分だったら出来るだけ生理的なリン酸化を見たいので１、２の順でやってみます。

mass spec によるリン酸化部位の同定について 削除/引用 No.1755-1 - 2008/08/12 (火) 04:57:22 - june リン酸化される可能性のあるタンパク質を見つけました。 リン酸化サイトを決めたいのですが、 １）細胞にタグ付の基質とkinaseを強制発現させて、基質のタグでIPしてから（泳動しゲルからバンドを切り出して）mass specで読む か ２）大腸菌に発現させた基質をGSTなどで精製して、in vitroでkinaseと混ぜてから（泳動しゲルからバンドを切り出して）mass specで読む という方法を二つ見つけましたが、どちらの手法の方がより簡単にリン酸化を検出できるでしょうか？ kinaseによるのでしょうか？ちなみにkinaseのめぼしはついていて、recombinant　kinaseが5 ug三万円程度で購入できます。

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